1、包裹 RuBpy 二氧化硅熒光納米探針的制備及其用于肝 癌細胞的識別1 引言隨著納米技術的迅猛發展， 各種各樣的納米材料已被廣泛應 用于 生物分析、 物質分離、 疾病診斷和治療等生物醫學領域。 熒 光納米材料， 如半導體熒光量子點、 碳點和包裹染料的二氧化硅 納米顆粒等， 通過 表面偶聯生物功能分子 （如抗體或適配體） 后， 形成具有靶向功能的 熒光納米探針， 從而應用于高靈敏的生物分 析 1? 7。生物分析最 常用的標記材料是有機熒光分子， 但具有 易光漂白、生物相容性較差 等缺點，極大地限制了其應用。為了 克服有機熒光染料的上述缺點， 開 發具有光穩定性的熒光標記材 料，成為人們關注的目標

2、。 二氧化硅復 合熒光納米顆粒不僅具有 良好的生物相容性、 表面易修飾、 抗光漂白性、 低成本、易分離 和良好親水性等優點 8， 9 ，而且能夠使核酸酶 遠離固定在其表 面的 DNA 分子， 從而保護 DNA 免受核酸酶的降解 10 ? 12 。由于 抗體能與抗原特異性結合， 目前已有研究將抗體分子偶 聯到二氧 化硅納米顆粒制備具有靶向性的熒光納米探針， 并將其用于 細菌 檢測、癌細胞識別和抗原檢測等方面 13? 17 。癌胚抗原（ CEA 是一種分子量為 180? 200 kDa 的多糖蛋 白復合 物， 屬于腫瘤細胞表面的結構抗原。 CEA 作為一種最常見 的腫瘤標 志物， 被廣泛用作各種消

3、化系腫瘤的診斷及監測指標 18 。免疫標記成像法是一種常見的原位檢測腫瘤標志物的方法， 它通過研究細胞膜或細胞內部特定生物化學參數的變化與差 異來實現 對腫瘤細胞的識別與檢測，操作簡單、結果直觀，在癌 癥的診斷和轉移 研究領域具有重要意義。本實驗以肝癌細胞膜表面 CEA 為靶標，將包裹釘聯吡啶（RuBpy ） 的二氧化硅復合熒光納米顆粒表面生物功能化，制備成可進行生物標記的納米探針，分別用于肝癌細胞 LM 9、Huh 7 的識別與成像。與染料分子相比，帶正電荷的 RuBpy 分子通過靜 電作 用能夠被穩定地束縛在帶有負電荷的二氧化硅矩陣里， 二氧 化硅殼層 的保護使自由氧不能接近熒光染料分子。

4、 同時， 大量的 染料分子被包 裹在二氧化硅納米顆粒核內， 從而起到信號放大的作用 19? 21。2 實驗部分2.1 儀器與試劑二氧化硅納米顆粒形貌及粒徑采用日本 JEM100CXII 型透射 電鏡 進行測定；官能團表征采用美國 Nicolet 5700 型紅外光譜 儀測量；細 胞成像采用 Nikon ECLIPSE TE2000 U 熒光倒置顯微 鏡。曲拉通（ Triton X 100 ）、環己烷、正己醇、氨水、正硅酸 四乙酯 （TEOS 、羧基乙基硅烷三醇鈉鹽（CEOS 、 羥基（聚 乙二醇） 丙基 三乙氧基硅烷（ HPEOPES 、 1 乙基 （3 二甲 基氨基丙 基）碳二亞胺鹽酸鹽（

5、EDC、N 羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo NHS、親和素（Avidin ）、2 （N嗎啡啉乙磺酸（MES、 釘 聯吡啶 （ Rubpy ） , 均購于 Sigma 公司；人肝癌 LM 9 細胞株 由武漢大 學中南醫院提供；人肝癌 Huh 7 細胞株購于中國典型 物培養中心；其 它試劑均為分析純， 實驗用水均采用三次蒸餾水。2.2 表面官能團修飾的二氧化硅熒光納米顆粒合成 包裹染料的二氧化硅納米顆粒合成采用油包水（ W/O 的反 相微乳法 22 。首先取 1.77 mL Triton X 100 、 7.5 mL 環己烷、 1.6 mL 正己醇和 400 卩 L 水，于室溫下磁力攪拌 10 m

6、in 后形成 微乳體系； 在此體系中加入 80 卩 L 濃度為 0.1mol/L 釘聯吡啶 溶液，攪拌 5 min ， 加入 100 卩 L TEOS 攪拌 30 min 后再加入 60 卩 L 氨水在室溫下攪拌用 于引發形成核殼結構。 24 h 后，向 體系中加入 50 卩 L TEOS 和 50 卩 L CEOS 在室溫下進一步攪拌 12 h 可 以得到羧基修飾的二氧化硅納米顆粒（ RSiNPs COOH ； 而 PEG 修飾 的二氧化硅納米顆粒（ RSiNPs PEG 則加入 100 a L TEOS 和 100 a L HPEOPE S 當反應完成時，用丙酮破乳，最后分 別用乙醇和水離

7、心洗滌 3 次，將得到的納米顆粒經真空冷凍干燥 后備用。2.3 親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針的制備2.3.1 探針 A 的制備 將 1 mg EDC 、 2.5 mg Sulfo NHS 和 1 mg 羧基修飾的納米顆粒一起加入到 1 mL 0.1 mol/L MES 緩沖 液中， 并 在室溫下活化反應 15 min 。整個溶液經離心洗滌后重 新分散在 1 mLPBS 緩沖液（ pH 7.4 ）中，立即加入 50 a L 1 g/L 親和素后， 在室 溫下置于搖床反應 2 h ，隨后向溶液中加入 100 卩 L 含有 2%牛血清蛋白的 PBS 緩沖液封閉 1 h 。待反應完成后， 經離 心

8、洗滌后親和素修飾的納米顆粒被重新分散在 PBS 緩沖液（pH 7.4 ）中，并在4 C下保存備用。2.3.2 探針 B 的制備將 1 mg PEG 修飾的納米顆粒分散到 1 mL 2 mol/L Na2CO3 緩沖 液中，充分混勻后，立即加入 1 mL 溴化氰的乙腈溶液（ 0.8 g/mL ）， 室溫下攪拌15 min ,經活化的納米顆粒用冰水和 PBS緩沖液（pH 7.4 ） 各洗 2次后，分散到 1mL PBS 緩沖液，立即向 溶液中加入 50 卩 L 1 mg/mL 親和素，置于 4 °C 反應 24 h , 待 反應完成后加入 100 卩 L 含有 2%牛血清蛋白的 PBS

9、緩沖液，在 4 C 過夜。經過反復離心洗滌后親和 素修飾的納米顆粒被重新分 散在 PBS 緩沖液（ pH7.4 ）中，并在 4 C 下保存備用。2.4肝癌細胞的培養與識別2.4.1 肝癌細胞的培養 將肝癌細胞 LM 9、Huh 7 用 DME 培 養基 （含 1 0%小牛血清、 100 mg/L 鏈霉素和 100 mg/L 青霉素） 吹散，于 5% CO2 37 C 培養箱中培養。待細胞鋪滿培養瓶底部 90% 寸，用 1mL 1% 胰蛋白酶消化液處理細胞 1? 3 min ，待細 胞脫離培養瓶壁，加 入 9 mL DME 培養基，待細胞吹勻后將其平 均分裝在兩個培養瓶中。 取一定體積的細胞接種

10、于 96 孔培養板 中繼續培養，培養至細胞密度達 到50%? 80% 寸用于實驗。培養與傳代寸所用器皿及試劑均進行過高壓滅菌或過濾除菌。2.4.2 肝癌細胞 LM 9 的識別分別取 100 卩 L 探針 A 和探針 B 到已固定好 LM 9 細胞的培 養板中，并在每孔補加100卩L PBS緩沖液（pH 7.4 ）置于37 C下孵育2 h，孵育完成后，再用 PBS 緩沖液洗滌 3 次，以除去 沒有反應的探針。對 照組與實驗組操作的區別在于前者不加兔抗 CEA 抗 體。2.4.3 肝癌細胞 Huh 7 的識別取 100 卩 L 探針 B 到已固定好 Huh 7 細胞的培養板中，并在 每孔 補加10

11、0卩L PBS緩沖液（pH 7.4 ）置于37 C下孵育2 h,孵育完成 后，再用 PBS 緩沖液洗滌 3 次，以除去沒有反應的探 針。對照組與實 驗組操作的區別在于前者不加兔抗CEA 抗體。3 結果與討論3.1 二氧化硅熒光納米顆粒大小形貌表征 采用透射電鏡對合成的羧基和 PEG 修飾的二氧化硅的進行 了表征，從圖 1 可見，羧基和 PEG 修飾納米顆粒都有很均一的尺 寸，粒徑約為 60 nm 。此外，通過高分辨電鏡可以明顯地觀察到 包裹熒光染料二氧化 硅納米顆粒的核殼結構。3.2 熒光光譜和紅外表征實驗表明，熒光染料 RuBpy 溶液的熒光發射光譜的最大發射 波長 為 610 nm , 本

12、研究制備的兩種包裹 RuBpy 的熒光納米顆粒 RSiNPs COOI 和 RSiNPs PEG 均發射明亮的紅色熒光，其最大發 射波長分別為 609 和 610 nm 因此，二氧化硅基本上不影響 RuBpy 的熒光發射光譜。通過紅外光譜對二氧化硅球表面的官能團進行了證實， 結果 如圖2 所示。 特征峰歸屬如下： 3400 cm1100Symbolm 1 左右的為 OH 的反對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，cmSymbolm 1 附近的吸收峰為亞甲基的伸縮振動，證明二氧化 硅復 合納米顆粒表面已分別成功修飾上了羧基和PEG 。3.3 肝癌細胞識別和成像采用間接免疫熒光法對肝癌細胞表面的 CEA 進

13、行標記，并通 過抗原 抗體、生物素 親和素之間的特異性結合來實現對靶標的 免疫熒 光標記成像，從而實現對肝癌細胞的識別。分別使用RSiNPs COOH RSiNPs PEG 乍為信號指示探針對肝癌細胞 LM 9 表面 的 CEA 進行標記。為了考察納米探針是通過抗原抗體特異性靶向模式與肝癌 細胞結 合， 還是通過非特異性吸附于肝癌細胞表面， 設置了對照 組實驗：以 PBS 代替兔抗 CEA 抗體 IgG 。探針 A 和探針 B 對 LM9 中 CEA 的標記 結果如圖 3 所示。在探針 A 對細胞的識別實驗組中，在熒光圖像中可觀察到部 分肝 癌細胞 LM 9 表面發出了紅色熒光，而在明場和熒光

14、的疊加 圖像中，部 分細胞并未發出紅色的熒光， 這可能是因為探針 A 與 細胞之間存在空 間位阻，僅有部分細胞被標記。而在探針 B 的識 別實驗組中，熒光顯微 鏡下可觀察到絕大部分肝癌細胞 LM 9 表 面發出了強烈的紅色熒光， 在明場和熒光場的疊加圖中絕大部分 的細 胞均發出了紅色熒光， 說明了肝癌細胞 LM 9 表面結合了大 量的探針 B。 在相應的對照組中，肝癌細胞幾乎沒有熒光信號， 說明探針 B 與肝癌細這表明探針胞之間無明顯的非特異性吸附B 是以抗體 抗原結合模式結合到肝癌細胞表面的，同時也說明在 avidin與 PRSiNPs 之間的 PEG 分子，極大地提高了 Avidin 分

15、子的自由度和 活性 23 ， 24 。上述方法具有普適性， 基于相同模式， 在理論上可以用于多 數 癌細胞的標記。為了進一步證明這種間接免疫熒光法的普適 性，使用探 針 B 對另一種肝癌細胞 Huh 7 的表面 CEA 進行了標 記，結果如圖 4 所 示。在熒光顯微鏡下可觀察到實驗組的肝癌細胞 Huh 7 表面發出 強烈的紅色熒光，說明肝癌細胞 Huh 7 表面結合了大量探針 B。 同時， 在對照組中，肝癌細胞上幾乎未觀察到熒光信號，說明探 針 B 與肝癌 細胞之間無明顯非特異性吸附。 明場和熒光的疊加圖 像清楚地表明該 探針對癌細胞具有很高的識別效率。 因此，基于 探針 B 的間接免疫熒 光

16、法具有較好的普適性。4 結論制備了羧基和 PEG 修飾的包裹釘聯吡啶二氧化硅熒光納米 顆粒， 設計了兩種用親和素修飾的二氧化硅熒光納米探針， 并 對肝癌 LM 9 細胞標記，結果表明：表面修飾 PEG 分子的納米探 針能有效地識別癌細胞表面靶蛋白， 從而實現癌細胞的識別和檢 測。采用此探針成功地對肝癌 Huh7 細胞進行了識別，并驗證了 該方法 的普適性。References1 Chan W C W ， Nie S M.Science ， 1998 ， 281 （ 5385 ）： 2016-20182 Tan W H ， Wang K M ， He X X ，Zhao X J ，Drake T

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