1、 化學發光免疫分析一、化學發光免疫技術的概念二、化學發光免疫分析基本原理三、化學發光免疫分析的類型四、臨床應用五、發展與展望一、化學發光免疫技術的概念 化學發光免疫技術：化學發光分析是根據化學反應產生的輻射光的強度來確定物質含量的分析方法。化學發光免疫分析是將化學發光系統與免疫反應相結合，用化學發光相關的物質標記抗體或抗原，與待測的抗原或抗體反應后，經過分離游離態的化學發光標記物，加入化學發光系統的其它相關物產生化學發光，進行抗原或抗體的定量或定性檢測。 化學發光免疫測定是目前世界公認先進的標記免疫測定技術，化學發光免疫分析技術具有高度的準確性和特異性，成為檢驗方法中最為重要的技術之一。化學發

2、光免疫分析技術作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機體免疫功能、傳染性疾病、內分泌功能、腫瘤標志物、性激素、甲狀腺功能等方面的體外診斷實驗中。化學發光免疫分析的優勢靈敏度高 靈敏度高是化學發光免疫分析關鍵的優越性，其靈敏度可達 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）。化學發光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯免疫分析等方法無法檢出的物質，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 寬的線性動力學范圍 發光強度在 4 6 個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優勢明顯。雖然 RIA 也有較寬的線性動力學范圍，但

3、放射性限制了其應用。 光信號持續時間長 輝光型的 CLIA 產生的光信號持續時間可達數小時甚至一天。簡化了實驗操作及測量。 分析方法簡便快速 絕大多數分析測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。 結果穩定、誤差小 樣品系直接自己發光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩定性、光散射、光波選擇器等）給分析帶來的影響，使分析結果靈敏穩定可靠。 安全性好及使用期長 免除了使用放射性物質。到目前為止，還未發現其危害性；試劑穩定，保存期可達一年。 二、化學發光免疫分析基本原理 化學發光免疫分析包含兩個部分, 即免疫反應系統和化學發光分析系統。免疫反應系統是將標記物質標記在抗原或抗體上

4、, 經過特異性免疫反應后,形成抗原2抗體復合物。然后進行對標記物進行檢測, 來測定待檢物。化學發光分析系統是利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個激發態的中間體, 當這種激發態中間體回到穩定的基態時, 同時發射出光子, 利用發光信號測量儀器光量子產率。2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結合形成抗原2抗體復合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據其檢測方法可分為非標記免疫分析和標記免疫分析。非標記免疫分析是利用抗原與抗體結合形成抗原2抗體復合物后, 其理化性質發生改變,出現肉眼可見的沉淀、凝集等現象,利用這些現象來檢測待檢物。標記免疫分析是在不影響抗原、

5、抗體生物活性的基礎上將標記物質標記在抗原或抗體上, 然后進行免疫反應形成抗原2抗體復合物, 再對標記質進行檢測, 從而間接檢測待檢物的方法 。目前常用的標記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等。2.2 化學發光原理 化學發光(Chemiluminescence, CL)是化學物質在特定化學反應中產生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學反應中激發單態分子形成,分子被激發后是不穩定的,它要釋放出多余的能量而回到基態,其中部分的能量以發光形式釋放出來。因此,任何一個化學發光反應包括兩個過程:激發和發光過程。一些激發態分子能量也會通過系間串躍和系內串躍而消失

6、。因此,化學發光反應的效率是: CL =CEEM (1) 式中,CL為化學發光效率,CE為生成激發態的效率, EM為激發態的發光效率。CE和EM分別定義為：CE = 生成激發態的分子數/ 參加反應的分子數 (2)EM = 發光的分子數/ 生成激發態的分子數 (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學發光的效率CL等價于生成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發光的分子數/ 參加反應的分子數 (4)2.3 化學發光免疫分析的原理 化學發光免疫分析法是化學發光和免疫分析結合的產物。它同時具有化學發光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性。化學發光免疫分析是用化學發光反應的試劑標記抗原或抗體, 標

7、記后的抗原和抗體與待測物經過一系列的免疫反應和理化步驟,最后以測定發光強度形式測定待測物的含量。三、化學發光免疫分析的類型 化學發光免疫分析法根據其標記物的不同可分為三大類,即化直接化學發光免疫分析、化學發光酶免疫分析和電化學發光免疫分析法。 用吖啶酯直接標記抗體用吖啶酯直接標記抗體( (抗原抗原) )，與待測標本中相，與待測標本中相應的抗原應的抗原( (抗體抗體) )發生免疫反應后，形成固相包被抗發生免疫反應后，形成固相包被抗體體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（入氧化劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成

8、堿性環境，吖啶酯在使成堿性環境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發光不需要催化劑的情況下分解、發光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。標準曲線上計算出待測抗原的含量。3.1 3.1 直接化學發光免疫分析直接化學發光免疫分析發光YYY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶吖啶酯標記物抗體帶吖啶酯標記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后（1 1）加入加入H H2 2O O2 2（pH10）直接化學

9、發光的機理直接化學發光的機理磁磁微粒微粒模式圖模式圖Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特點特點 抗原和抗體結抗原和抗體結合與未合與未結合部結合部分分的的易易分離分離磁微粒磁微粒技術技術 化學發光酶免疫分析化學發光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發光反應的酶）是用參與催化某一化學發光反應的酶如辣根過氧化物酶（如辣根過氧化物酶（HRP）或堿

10、性磷酸酶或堿性磷酸酶(ALP)(ALP)來標記抗原或抗來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原體，在與待測標本中相應的抗原( (抗體抗體) )發生免疫反應后，形成發生免疫反應后，形成固相包被抗體固相包被抗體- -待測抗原待測抗原- -酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物底物( (發光劑發光劑) )，酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接，酶催化和分解底物發光，由光量子閱讀系統接收，光電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把它們收，光電倍增管將光信號轉變為電信號并加以放大，再把它們傳送至計算機數據處理系統，計算出測定物的濃度。傳送至計算機數據處理系統，計算

11、出測定物的濃度。3.23.2、化學發光酶免疫分析、化學發光酶免疫分析該分析系統采用辣根過氧化物酶（該分析系統采用辣根過氧化物酶（HRP）標）標記抗體記抗體(或抗原或抗原)，在與反應體系中的待測標，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體被抗體-待測抗原待測抗原-酶（酶（HRP）標記抗體復合）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發光劑、物，這時加入魯米諾發光劑、H2O2和化學發和化學發光增強劑使產生化學發光。光增強劑使產生化學發光。 辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析辣根過氧化物酶標記化學發光免疫分析

12、示意圖辣根過氧化物酶標記化學發光免疫分析示意圖 該分析系統以堿性磷酸酶該分析系統以堿性磷酸酶 標記抗體標記抗體(或抗原或抗原)，在與反應體系中的待測標本和固相載體發生在與反應體系中的待測標本和固相載體發生免疫反應后，形成固相包被抗體免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原待測抗原-酶酶標記抗體復合物，這時加入標記抗體復合物，這時加入AMPPD發光劑，發光劑，堿性磷酸酶使堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發光。脫去磷酸根基團而發光。 堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析堿性磷酸酶標記化學發光免疫分析示意圖堿性磷酸酶標記化學發光免疫分析示意圖 分配樣品,磁顆粒和試劑孵

13、育使反應物結合在磁場中清洗去除未結合物質加入底物產生信號孵育,促使信號的產生信號檢測電化學發光免疫分析電化學發光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學發光劑三聯吡啶釕標記是以電化學發光劑三聯吡啶釕標記 抗體抗體( (抗原抗原) )，以三丙胺，以三丙胺(TPA)(TPA)為電子供體，為電子供體， 在電場中因電子轉移而發生特異性化學發光在電場中因電子轉移而發生特異性化學發光 反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。 3.3 3.3 電化學發光免疫分析電化學發光免疫分析在電化學發光免疫分析系統中

14、，磁性微粒為固相載體在電化學發光免疫分析系統中，磁性微粒為固相載體包被抗體包被抗體( (抗原抗原) )，用三聯吡啶釕標記抗體，用三聯吡啶釕標記抗體( (抗原抗原) )，在，在反應體系內待測標本與相應的抗原反應體系內待測標本與相應的抗原 ( (抗體抗體) )發生免疫發生免疫反應后，形成磁性微粒包被抗體反應后，形成磁性微粒包被抗體- -待測抗原待測抗原- -三聯吡啶三聯吡啶釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，釕標記抗體復合物，這時將上述復合物吸入流動室，同時引人同時引人TPATPA緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，緩沖液。當磁性微粒流經電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合

15、的標記被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結合的標記抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動抗體和標本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學發光反應，使三聯吡啶釕和電化學發光反應，使三聯吡啶釕和TPATPA在電極表面進在電極表面進行電子轉移，產生電化學發光，光的強度與待測抗原行電子轉移，產生電化學發光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。的濃度成正比。電化學發光免疫分析示意圖電化學發光免疫分析示意圖電化學發光免疫測定示意圖電化學發光免疫測定示意圖標記磁顆粒在電場中發光工作示意圖標記磁顆粒在電場中發光工作示意圖 四、臨床應用四、臨床應用 1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 2.2.生殖激素生殖激

16、素 3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 4.4.貧血因子貧血因子 5.5.腫瘤標記物腫瘤標記物 6.6.感染性疾病感染性疾病 7.7.糖尿病糖尿病 8.8.心血管系統心血管系統 9.9.病毒標記物病毒標記物 10.10.骨代謝骨代謝 11.11.過敏性疾病過敏性疾病 12.12.治療藥物監測治療藥物監測 五、發展與展望 化學發光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設備簡單等優點，近年來在環境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發展。近幾年化學發光免疫分析法的研究方

17、向主要涉及到降低溫育時間，多組分檢測，以及信號放大技術等。這些例子都證明了化學發光免疫分析法具有廣泛的應用前景和可操作性。 此外，化學發光成像技術、化學發光免疫分析與分離技術的聯用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度和檢測速度、檢測通量得到進一步提高。為了更好地適應臨床、環境等領域的實際應用，需要大力發展微型化、集成化和自動化的化學發光免疫分析儀器。隨著分子生物學及納米與傳感技術的進步，新的化學發光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發展，開發催化活性更高、穩定性更好、發光動力學曲線更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測，發展新型標記技術用于信號放大，建立化學發光免疫分析新方法，都將是未

18、來的發展方向及研究重點。化學發光免疫分析的優勢靈敏度高 靈敏度高是化學發光免疫分析關鍵的優越性，其靈敏度可達 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）。化學發光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯免疫分析等方法無法檢出的物質，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。 2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結合形成抗原2抗體復合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據其檢測方法可分為非標記免疫分析和標記免疫分析。非標記免疫分析是利用抗原與抗體結合形成抗原2抗體復合物后, 其理化性質發生改變,出現肉眼可見的沉淀、凝集等現象,利用這些現象來檢測待檢物。標記免疫

19、分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎上將標記物質標記在抗原或抗體上, 然后進行免疫反應形成抗原2抗體復合物, 再對標記質進行檢測, 從而間接檢測待檢物的方法 。目前常用的標記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系稀土元素等。 用吖啶酯直接標記抗體用吖啶酯直接標記抗體( (抗原抗原) )，與待測標本中相，與待測標本中相應的抗原應的抗原( (抗體抗體) )發生免疫反應后，形成固相包被抗發生免疫反應后，形成固相包被抗體體- -待測抗原待測抗原- -吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（入氧化劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成堿性環境，吖啶酯在使成堿性環境，吖啶酯在不需