1、PFGE分型技術(shù)和技術(shù)參數(shù)設(shè)置分型技術(shù)和技術(shù)參數(shù)設(shè)置金東 2010年6月PFGE原理及相關(guān)參數(shù)原理及相關(guān)參數(shù)PFGE原理及相關(guān)參數(shù)原理及相關(guān)參數(shù)超過一定大小的線狀雙鏈超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度后速率遷移。大于該極限長度后DNA的遷移速度幾乎與分子的遷移速度幾乎與分子大小無關(guān)。當(dāng)大小無關(guān)。當(dāng)DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，卷曲分子的有效直徑超過凝膠孔徑時，卷曲的的DNA分子在電場作用下會沿電場方向拉伸變形擠過篩孔，分子在電場作用下會沿電場方向拉伸變形擠過篩孔，凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)不明顯，此時凝膠介質(zhì)的分子篩效應(yīng)不明顯，

2、此時DNA分子在電場中的分子在電場中的遷移速度主要取決于電場強度。遷移速度主要取決于電場強度。有實驗證明長度大于有實驗證明長度大于40KB的的DNA分子不能在恒強水平瓊脂分子不能在恒強水平瓊脂糖凝膠電泳中分離。糖凝膠電泳中分離。 PFGE原理及相關(guān)參數(shù)原理及相關(guān)參數(shù)脈沖場凝膠電泳可以分離長至脈沖場凝膠電泳可以分離長至50MB的的DNA分子。其原理是分子。其原理是DNA分子在交替分子在交替變換方向的電場中做出反應(yīng)的時間取決于它的大小。較小的分子重新定向較變換方向的電場中做出反應(yīng)的時間取決于它的大小。較小的分子重新定向較快，因而在凝膠中移動也快，于是不同大小的分子被成功分離。快，因而在凝膠中移動也

3、快，于是不同大小的分子被成功分離。DNA分子在分子在交替電場作用下的行為可以用分子的延展性和沿電場方向平行泳動前的重新交替電場作用下的行為可以用分子的延展性和沿電場方向平行泳動前的重新定向解釋。定向解釋。DNA分子以蠕行（分子以蠕行（reptation）方式在瓊脂糖凝膠的連續(xù)孔洞中遷）方式在瓊脂糖凝膠的連續(xù)孔洞中遷移。當(dāng)電場變換方向時，移。當(dāng)電場變換方向時，DNA分子在新的方向泳動前必須再定向。所以，電分子在新的方向泳動前必須再定向。所以，電場方向有規(guī)律地變換，場方向有規(guī)律地變換，DNA也必須有規(guī)律地改變泳動方向。分子越大重新定也必須有規(guī)律地改變泳動方向。分子越大重新定向需要的時間越長，于是在

4、每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，向需要的時間越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，最終達(dá)到了分離的目的。最終達(dá)到了分離的目的。目前常用的脈沖場凝膠電泳儀器為箝位勻強電場系統(tǒng)（目前常用的脈沖場凝膠電泳儀器為箝位勻強電場系統(tǒng)（contour-clamped homogeneous electric field, CHEF）方框代表瓊脂糖凝膠，一排長方形小框代表方框代表瓊脂糖凝膠，一排長方形小框代表DNA加樣孔，六邊形代表加樣孔，六邊形代表CHEF系系統(tǒng)的電極（統(tǒng)的電極（4X6）。當(dāng)電泳工作時，）。當(dāng)電泳工作時，DNA分子以箭頭方向遷移。分子以箭頭方向遷移。PFGE原理及相

5、關(guān)參數(shù)原理及相關(guān)參數(shù)影響分辨率的因素影響分辨率的因素影響分辨率的因素包括：脈沖時間、電場夾角、電場強度、影響分辨率的因素包括：脈沖時間、電場夾角、電場強度、電影溫度、緩沖液以及電泳時間等。在脈沖場凝膠電泳中電影溫度、緩沖液以及電泳時間等。在脈沖場凝膠電泳中通常包括脈沖時間、電場強度、溫度、緩沖液組成、瓊脂通常包括脈沖時間、電場強度、溫度、緩沖液組成、瓊脂糖類型和濃度以及電場夾角等參數(shù)而只是改變脈沖時間來糖類型和濃度以及電場夾角等參數(shù)而只是改變脈沖時間來控制分辨樣品的范圍，即通過增加脈沖時間分離較大分子，控制分辨樣品的范圍，即通過增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間來分離較小分子。減少脈沖時間

6、來分離較小分子。 脈沖時間是指電場在某個角度持續(xù)的時間。脈沖時間是指電場在某個角度持續(xù)的時間。例如：脈沖時間為例如：脈沖時間為30s，即電場方向?qū)冢措妶龇较驅(qū)?0s變換一次。脈沖時變換一次。脈沖時間是脈沖場電泳的核心參數(shù)。通常實驗中使用的脈沖時間為一個范間是脈沖場電泳的核心參數(shù)。通常實驗中使用的脈沖時間為一個范圍值如：圍值如：220S。這樣是為了使一定范圍內(nèi)的。這樣是為了使一定范圍內(nèi)的DNA片段都可以得片段都可以得到理想的分離。這種脈沖時間的變換可以是線性的或者是非線性的。到理想的分離。這種脈沖時間的變換可以是線性的或者是非線性的。線性是指脈沖時間在一定的電泳時間內(nèi)是均勻變換的；而非

7、線性的線性是指脈沖時間在一定的電泳時間內(nèi)是均勻變換的；而非線性的變換可以使一定的脈沖時間相對集中，從而使相應(yīng)大小的片斷得到變換可以使一定的脈沖時間相對集中，從而使相應(yīng)大小的片斷得到更好的分離。更好的分離。脈沖時間脈沖時間脈沖時間脈沖時間不同脈沖時間對帶型的影響不同脈沖時間對帶型的影響2.2-54.2s2-30s2-35s2-25s隨著大脈沖時間的縮短大片段的位置也在逐漸靠近加樣孔，同時小片段也有不錯的分離效果。電場夾角電場夾角使用較小的電場夾角可以分離較大的使用較小的電場夾角可以分離較大的DNA片段，而大的片段，而大的電場夾角分離較小的片段。當(dāng)使用較小的電場夾角時，電場夾角分離較小的片段。當(dāng)使

8、用較小的電場夾角時，小片段會變的相對集中。小片段會變的相對集中。大部分基于大部分基于CHEF脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場夾角為的電場夾角為120度。度。1201001059694電場角度電場角度隨著電場角度的減少，兩個大片段分的更開。但是同時小片段也在逐漸的壓縮。所以為了兼顧不同大小的片段需要選擇一個合適的電場角度。2.2 Mb1.6 Mb大部分基于大部分基于CHEF脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場夾角為脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場夾角為120。電場強度電場強度電場強度以電場強度以V/cm來表示的。因為通常的來表示的。因為通常的CHEF

9、型脈沖場型脈沖場凝膠電泳膠區(qū)的長度為凝膠電泳膠區(qū)的長度為33cm，所以，所以200V的電壓實際上的電壓實際上為為6V/cm。使用較高的電場強度可以分離較大的。使用較高的電場強度可以分離較大的DNA片片段，反之亦然。段，反之亦然。大部分基于大部分基于CHEF脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)的操作手冊使用的電場強度為的電場強度為6V/cm。緩沖液類型緩沖液類型脈沖場凝集電泳中的緩沖液選擇需要考慮兩方面的問題：脈沖場凝集電泳中的緩沖液選擇需要考慮兩方面的問題：緩沖液的緩沖能力以及長電泳時間中液體的損耗問題。緩沖液的緩沖能力以及長電泳時間中液體的損耗問題。通常用于脈沖場凝膠電泳的電泳

10、緩沖液包括兩種通常用于脈沖場凝膠電泳的電泳緩沖液包括兩種0.5XTBE和和1XTAE，其中，其中1XTAE常用于常用于MB級的級的DNA片片斷的分離（斷的分離（3MB），而），而0.5XTBE常用于常用于1MB的片斷的片斷的分離。的分離。 電泳溫度電泳溫度脈沖場凝膠電泳通過冷凝以及循環(huán)系統(tǒng)實現(xiàn)對電泳緩沖液脈沖場凝膠電泳通過冷凝以及循環(huán)系統(tǒng)實現(xiàn)對電泳緩沖液的溫度控制。的溫度控制。當(dāng)緩沖液的溫度越高，電泳所需要的時間也就越短。但是，當(dāng)緩沖液的溫度越高，電泳所需要的時間也就越短。但是，較高的溫度會造成條帶彌散，影響分辨率。較高的溫度會造成條帶彌散，影響分辨率。通常使用的緩沖液的溫度為通常使用的緩沖液

11、的溫度為1215。在這個溫度內(nèi)。在這個溫度內(nèi)可以最好的兼顧電泳時間和分辨率。可以最好的兼顧電泳時間和分辨率。瓊脂的種類以及瓊脂的濃度瓊脂的種類以及瓊脂的濃度使用的瓊脂糖濃度越低，所能分離的使用的瓊脂糖濃度越低，所能分離的DNA片段越大。但片段越大。但是瓊脂的濃度低，其機械強度也低，實驗操作中的難度是瓊脂的濃度低，其機械強度也低，實驗操作中的難度也會加大。也會加大。在脈沖場凝膠電泳中使用的瓊脂糖應(yīng)當(dāng)具備以下的特點：在脈沖場凝膠電泳中使用的瓊脂糖應(yīng)當(dāng)具備以下的特點：1、機械強度大，利于實驗操作、機械強度大，利于實驗操作2、純度高，高純度的瓊脂可提高電泳的分辨率、純度高，高純度的瓊脂可提高電泳的分辨

12、率3、熔點低，包埋細(xì)菌時凝膠的溫度不易過高、熔點低，包埋細(xì)菌時凝膠的溫度不易過高電泳時間電泳時間電泳時間需要在分辨率和總的實驗時間之間尋找一個平電泳時間需要在分辨率和總的實驗時間之間尋找一個平衡點。因為通常希望盡快完成實驗，因此理論上說電泳衡點。因為通常希望盡快完成實驗，因此理論上說電泳的時間越短越好。但是短的電泳時間會降低實驗的分辨的時間越短越好。但是短的電泳時間會降低實驗的分辨率從而影響實驗結(jié)果。率從而影響實驗結(jié)果。在在PulseNet標(biāo)準(zhǔn)操作中的電泳時間并不是固定的標(biāo)準(zhǔn)操作中的電泳時間并不是固定的,其要其要求是標(biāo)準(zhǔn)菌種求是標(biāo)準(zhǔn)菌種H9812中中20Kb左右的片段達(dá)到膠的下沿左右的片段達(dá)到

13、膠的下沿1-1.5cm.基因組基因組DNA的制備的制備為防止大的為防止大的DNA片段斷裂，片段斷裂，PFGE所用的樣品是從瓊脂所用的樣品是從瓊脂糖包埋活細(xì)菌中制備的。預(yù)先細(xì)菌定量很重要，這是因糖包埋活細(xì)菌中制備的。預(yù)先細(xì)菌定量很重要，這是因為為PFGE中的中的DNA的泳動相對于普通電泳對濃度的要求的泳動相對于普通電泳對濃度的要求更高，過多的更高，過多的DNA會造成泳動異常減慢。會造成泳動異常減慢。 以上是脈沖凝膠電泳的基本原理以及其影響因素，以上是脈沖凝膠電泳的基本原理以及其影響因素，因為因為PFGE操作繁瑣，其中影響因素很多，因此操作繁瑣，其中影響因素很多，因此需要仔細(xì)嚴(yán)格操作。需要仔細(xì)嚴(yán)格

14、操作。 PFGE操作基本流程操作基本流程PFGE操作的基本流程操作的基本流程革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌PFGE操作的基本流程操作的基本流程相對于容易破壁相對于容易破壁的革蘭氏陰性菌，的革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌通革蘭氏陽性菌通常需要使用溶菌常需要使用溶菌酶或者是其他試酶或者是其他試劑對其進(jìn)行預(yù)先劑對其進(jìn)行預(yù)先處理。處理。PFGE聚類分析原則聚類分析原則TENOVER原則與聚類分析原則與聚類分析不同研究者對于同樣的不同研究者對于同樣的PFGE帶型會有完全不同的解帶型會有完全不同的解釋，對于這些菌株是否屬于暴發(fā)相關(guān)或者暴發(fā)不相關(guān)釋，對于這些菌株是否屬于暴發(fā)相關(guān)或者暴發(fā)不相關(guān)的菌株也會有完全不同的意見

15、，對于的菌株也會有完全不同的意見，對于PFGE帶型上條帶型上條帶的差異也有不同的解釋。帶的差異也有不同的解釋。TENOVER原則是在沒有使用軟件進(jìn)行分析的時候原則是在沒有使用軟件進(jìn)行分析的時候PFGE帶型解釋方法。這個標(biāo)準(zhǔn)對于臨床實驗室分析帶型解釋方法。這個標(biāo)準(zhǔn)對于臨床實驗室分析一個小型的相關(guān)性較高的分離株（比較典型的菌株數(shù)一個小型的相關(guān)性較高的分離株（比較典型的菌株數(shù)小于等于小于等于30株）推斷是否屬于暴發(fā)更有意義。株）推斷是否屬于暴發(fā)更有意義。基本原則基本原則 一般而言，引起大流行的病原體大都來自遺傳結(jié)構(gòu)相同或相近的一般而言，引起大流行的病原體大都來自遺傳結(jié)構(gòu)相同或相近的生物。同源生物體是

16、同種的不同個體，具有相同的毒力因子、生生物。同源生物體是同種的不同個體，具有相同的毒力因子、生化特征和基因特性。然而，生物體在不同時間、不同來源、分離化特征和基因特性。然而，生物體在不同時間、不同來源、分離自不同地理區(qū)域，在種的層次仍存有其差異可分成亞型或基因型。自不同地理區(qū)域，在種的層次仍存有其差異可分成亞型或基因型。在流行病監(jiān)測方面，生物體分型對于感染性疾病大流行的辨識是在流行病監(jiān)測方面，生物體分型對于感染性疾病大流行的辨識是相當(dāng)重要的。例如監(jiān)測院內(nèi)病原菌的交叉感染、追蹤傳染來源和相當(dāng)重要的。例如監(jiān)測院內(nèi)病原菌的交叉感染、追蹤傳染來源和辨識具有高度毒力的生物體品系。辨識具有高度毒力的生物體

17、品系。菌株分型的目的是為了提供實驗室角度的證據(jù)。這一證據(jù)支持那些分離菌株分型的目的是為了提供實驗室角度的證據(jù)。這一證據(jù)支持那些分離自一次爆發(fā)中分離的流行相關(guān)的（自一次爆發(fā)中分離的流行相關(guān)的（epidemiologically related）菌株同）菌株同時也是遺傳相關(guān)的（時也是遺傳相關(guān)的（genetically related）菌株，從而證明這些菌株是同）菌株，從而證明這些菌株是同樣的菌株。樣的菌株。在使用細(xì)菌分型的結(jié)果進(jìn)行暴發(fā)研究時是基于以下幾個假設(shè)的：在使用細(xì)菌分型的結(jié)果進(jìn)行暴發(fā)研究時是基于以下幾個假設(shè)的：1. 屬于一次暴發(fā)的分離株來源于同一個祖先屬于一次暴發(fā)的分離株來源于同一個祖先2.

18、 這些菌株應(yīng)該具有相同的基因型這些菌株應(yīng)該具有相同的基因型3. 流行病學(xué)無關(guān)的菌株應(yīng)該有不同的基因型別流行病學(xué)無關(guān)的菌株應(yīng)該有不同的基因型別 實際上某些流行病學(xué)無關(guān)的菌株同樣會有相同或者相似的基因型。實際上某些流行病學(xué)無關(guān)的菌株同樣會有相同或者相似的基因型。例如大部分的耐青霉素的金葡菌來源于少數(shù)幾個祖先。所以一次例如大部分的耐青霉素的金葡菌來源于少數(shù)幾個祖先。所以一次暴發(fā)的菌株可能很難與本來存在的院內(nèi)感染的金葡菌區(qū)分。暴發(fā)的菌株可能很難與本來存在的院內(nèi)感染的金葡菌區(qū)分。基本原則基本原則基因事件與條帶變化基因事件與條帶變化無法區(qū)分無法區(qū)分：分離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株：分

19、離株有相同的帶型，包括條帶的數(shù)目和位置。這些分離株為同一菌株。為同一菌株。高度相關(guān)高度相關(guān)：如果：如果PFGE帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些帶型僅有因一次基因事件引起的帶型變化，這些菌株就被定義為高度相關(guān)菌株。這些僅有兩到三個條帶變化的情況常見菌株就被定義為高度相關(guān)菌株。這些僅有兩到三個條帶變化的情況常見于反復(fù)傳代以及從同一病人中多次分離的菌株。于反復(fù)傳代以及從同一病人中多次分離的菌株。可能相關(guān)可能相關(guān)：PFGE帶型與爆發(fā)菌株帶型變化有兩個獨立的基因事件引起帶型與爆發(fā)菌株帶型變化有兩個獨立的基因事件引起的條帶變化。（通常是的條帶變化。（通常是4到到6個條帶的變化）。這些分離株可能是

20、遺傳上個條帶的變化）。這些分離株可能是遺傳上相關(guān)的，但是并不是緊密相關(guān)的，其流行病學(xué)關(guān)系也并不緊密。相關(guān)的，但是并不是緊密相關(guān)的，其流行病學(xué)關(guān)系也并不緊密。這樣的突變常見于分離自較長的時間段（大于等于這樣的突變常見于分離自較長的時間段（大于等于6個月）或者是大規(guī)個月）或者是大規(guī)模延伸爆發(fā)的病人中。模延伸爆發(fā)的病人中。無關(guān)無關(guān)：三個獨立的基因事件引起的條帶變化（：三個獨立的基因事件引起的條帶變化（7個或者是以上的條帶變個或者是以上的條帶變化）。化）。TENOVER原則原則TENOVER原則的聚類方法原則的聚類方法首先，檢查所有的帶型看看能否發(fā)現(xiàn)一個暴發(fā)帶型或者是代表首先，檢查所有的帶型看看能否發(fā)

21、現(xiàn)一個暴發(fā)帶型或者是代表帶型。如果沒有發(fā)現(xiàn)代表帶型那么這些分離株很可能是流行病帶型。如果沒有發(fā)現(xiàn)代表帶型那么這些分離株很可能是流行病學(xué)無關(guān)菌株。（流行相關(guān)的菌株中沒有代表帶型的情況是小概學(xué)無關(guān)菌株。（流行相關(guān)的菌株中沒有代表帶型的情況是小概率事件）。率事件）。其次，以暴發(fā)帶型為基礎(chǔ)和其他分離株的帶型進(jìn)行比較。每個其次，以暴發(fā)帶型為基礎(chǔ)和其他分離株的帶型進(jìn)行比較。每個帶型應(yīng)該確定與暴發(fā)帶型關(guān)系。帶型差異超過帶型應(yīng)該確定與暴發(fā)帶型關(guān)系。帶型差異超過50%的分離株可的分離株可以認(rèn)為是暴發(fā)無關(guān)分離株。而那些與暴發(fā)帶型只有以認(rèn)為是暴發(fā)無關(guān)分離株。而那些與暴發(fā)帶型只有2到到3個條個條帶差異的分離株被認(rèn)為是暴發(fā)帶型的衍生。帶差異的分離株被認(rèn)為是暴發(fā)帶型的衍生。TENOVER原則的問題原則的問題PFGE圖譜上的一個條帶就一定是單一條帶嗎？圖譜上的一個條帶就一定是單一條帶嗎？TENOVER原則的問題原則的問題 如果基因事件發(fā)生在凝膠之外的片段？如果基因事件發(fā)生在凝膠之外的片段？ 質(zhì)粒對圖譜是否會產(chǎn)生影響？質(zhì)粒對圖譜是否會產(chǎn)生影響？ 圖譜中的條帶數(shù)目相同但是位置上有差異？圖譜中的條帶數(shù)目相同但是位置上有差異？只有帶型相似性在只有帶型相似性在100%的