1、精選優質文檔-傾情為你奉上產淀粉酶（-淀粉酶）細菌菌株篩選一、 實驗目的：1. 掌握從環境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2. 鞏固以前所學的微生物學實驗技術。3. 學習淀粉酶活性的測定方法。二、 實驗原理：1. -淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的產生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質的土壤等樣品中。2. 從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個步驟：采樣、富集培養、初步篩選、分離純化和性能測定。a) 采樣：即采集含菌種的樣品采集含菌樣品前應調查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做各項具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到

2、，因而土壤可說是微生物的大本營。例如廚房土壤、面粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多。b) 富集培養：富集培養就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質，并創造一些有利于待分離微生物生長的其他條件，使能分解利用這類物質的微生物大量繁殖，從而便于我們從其中分離到這類微生物。c) 初步篩選：i. （選擇培養基）初篩使用選擇培養基對菌種進行培養，通過培養基的特殊成分，來篩選出目的菌種，從而進行培養。ii. （鑒別培養基）初篩利用鑒別培養基，通過添加一些特殊的試劑或成分來鑒別出目的菌種，從而篩選出來并對其進行培養。d) 分離純化：通過上述的篩選只能說我們要分離的目的菌種已經存在，但還要把夾雜在其中的雜

3、菌除去，從而得到純種的菌落。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細胞分離法、菌絲尖端切割法等。e) 性能測定：分離純化得到的菌種之后，所分得的菌種是否具有實驗所要求的性能，還必須要進行性能測定后才能決定取舍。三、 實驗材料：1. 培養基配制：a) 培養基按以下比例配制后，加蒸餾水調至100%；b) 富集培養基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、pH7.0；c) 分離培養基：玉米粉2%、黃豆餅粉1.5%、瓊脂粉0.8%、CaCl 0.02%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.25%、K2HPO4 0.2%、檸檬酸鈉0

4、.2%、硫酸銨0.075%（溶解后加入）、Na2HPO40.2%、pH7.0。2. 主要試劑和溶液的配制：a) 2%淀粉溶液：準確稱取淀粉2g溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。b) 0.1mol/L的檸檬酸緩沖液、pH=1.0的鹽酸c) 1%的3，5-二硝基水楊酸：精確稱取1g3，5-二硝基水楊酸，溶于20ml 2mol/L氫氧化鈉溶液中，加入蒸餾水50ml，再加入四水酒石酸鉀鈉30g，待溶解后用蒸餾水定容100ml，蓋緊瓶塞，隔絕CO2。d) 0.1%葡萄糖溶液：準確稱取80烘干至恒重的無水葡萄糖0.1g，去離子水溶解后定容至100ml。e) 0.1%標準麥芽糖溶

5、液：稱取麥芽糖100mg，用蒸餾水溶解并定容至100ml。四、 實驗方法：1. 采樣與稀釋：a) 從實驗樓前的小樹林中采集土樣，稱取5g土樣，放入裝有 45mL無菌水的三角瓶中, 震蕩 20m in后靜置 5min。然后對其進行濃度梯度稀釋到10-6, 分別稀釋到10-4、10-5、10-6濃度下。2. 富集培養：a) 從上述土壤稀釋液中各取1 mL注入無菌培養皿中，然后倒入滅菌并融化冷卻至50左右的富集培養基，小心搖動冷凝后，倒置于37保溫箱中培養24小時。3. 初步篩選：a) 培養24小時后，取出平板，向平板中注入1滴革蘭氏碘液，因淀粉遇碘變藍色，如菌落周圍有無色透明圈，說明該菌能分解淀粉

6、，即該菌株可以產生淀粉酶。通過影印法或點種法將可以產生淀粉酶的菌株接種到相同的無菌培養中，重復操作進行培養。4. 分離純化：a) 初篩所得的菌落中選擇菌落周圍透明圈和菌落直徑之比值較大的菌落，進行劃線分離。將劃線分離后的培養皿放入37 培養箱中培養24小時。5. 性能測定：a) 標準曲線的制作：i. 取7支20ml預先潔凈滅菌干燥的試管，編號，加入試劑見表1。每個濃度做3個平行樣本。搖勻，至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml，以1號管作為空白調零點，在520nm的波長下比色測定吸光度值，并建立通過吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1 淀粉酶標準曲線的制作試管號麥芽糖標

7、準液（ml）麥芽糖含量（mg）（ml）3，5-二硝基水楊酸（ml）1002.02.020.20.21.82.030.60.61.42.041.01.01.02.051.41.40.62.061.81.80.22.072.02.002.0b) 酶活力測定：i. 首先制備待測粗酶液：取培養好菌株的分離培養基進行4000rpm離心20min，并收集上清液即為待測粗酶液。ii. 取20ml預先潔凈滅菌干燥的具塞刻度試管，編號。并按步驟操作：取粗酶液1.0ml加2%的可溶性淀粉1ml，蒸餾水3ml，于60 水浴中預熱5min加0.1ml/l檸檬酸緩沖液（pH6.0）1ml于60 水浴中保溫30min加3，5-二硝基水楊酸1.5ml，沸水浴中煮沸5min，迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml。iii. 空白對照：取粗酶液1.0ml，加入pH1.0的鹽酸鈍化淀粉酶