1、LncRNA-ANCR基因表達對大鼠退行性脊柱側凸影響的實驗研究退行性脊柱側凸(degenerative scoliosis ，DS) 通常指機體骨骼成熟后出現的脊柱腰段的側凸，冠狀面Cobb? 角大于 10 °，同時可以存在矢狀面失衡和/或脊椎的旋轉異常。隨著全球人口老齡化及老年人生活方式轉變，DS 已成為導致脊柱畸形、影響生活質量的一種腰椎退行性疾病。由于DS 的具體病因還未明確解釋，當前關于 DS 的研究絕大多數是針對治療，涉及病因學方面的基礎研究很少。因此，進一步研究DS 的病因及發病機制具有非常重要的意義。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA ，LncR

2、NA) 是長度大于200 個核苷酸的非編碼 RNA 。研究表明， LncRNA在調控表觀遺傳、細胞周期和細胞分化等細胞分化和個體發育的生命活動中發揮重要作用，并與人類疾病的發生密切相關，其中包括癌癥、 退行性疾病在內的多種嚴重危害人類健康的重大疾病，成為當前研究熱點。其中，ANCR （ anti-differentiation ncRNA，抗分化 ncRNA ）為一個 855bp lncRNA ，在細胞分化期間下調。ANCR 在包含祖細胞群體中的減少，沒有任何其他刺激，導致快速分化基因誘導。本研究正是選擇LncRNA-ANCR這一基因，旨在通過研究該基因和大鼠DS 之間作用關系，為進一步從分子

3、生物學水平研究DS 的發病機理，希望從發病的初始關鍵環節上預防該類型疾病發生。參考文獻（ 1）Dalle-Carbonare L ，Innamorati G ，Valanti MT Transcription factor Runx2 andits application to bone tissue engineeringJStem Cell Rev ，2012，8(3)：891 897.（ 2）Liu TM ，IR EH Tran scriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bonedevelopmentJ Tissue Eng P

4、art B Rev ， 2013， 19(3) ： 254 263.（ 3）Lin Zhu ，Pei-Cheng Xu ， Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblastdifferentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ， Biochemicaland Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617.（ 4） Glass DA. Canonical Wnt signaling in differentiated

5、 osteoblasts controls osteoclast differentiationJ Dev Cell ， 2010 ， 104(9) ： 16702 16707.（ 5）劉錫梅，馬越鳴，丁伯平等，大鼠兩種骨質疏松模型的建立J. 皖南醫學院學報， 2001,20(1) ： 4-5.（ 6）劉曉陽，邱貴興，翁習生等，長鏈非編碼RNA 在青少年特發性脊柱側凸中的表達研究 J. 中國骨與關節外科，2014,3（ 7） :235-240.（ 7） Daffner SD ， Vaccaro AR. Adult degene rative lumbarscoliosis.Am J Ortho

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7、actor-5 protein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ. Spine Journal ， 2008， 8（ 2） :287-295.創新點：LncRNA 是當前的研究熱點，在癌癥方面研究相對較多，本研究借此熱點探討LncRNA-ANCR在大鼠 DS 發生發展過程中的作用。若探明 LncRNA-ANCR和 DS 之間的作用關系，從而人為地調控LncRNA-ANCR的作用機制，從早期防治DS ，為防治DS 開辟一個新思路。實驗

8、設計與技術路線：1重組 LncRNA-ANCR腺病毒表達載體的構建、鑒定（ 1）根據LncRNA-ANCR前體序列應用Primer premier 5軟件設計引物。（ 2）利用PCR 技術擴增出LncRNA-ANCR前體的 DNA 序列。（ 3） LncRNA-ANCR前體的 DNA 序列重組入腺病毒miRNA 表達載體。（ 4）應用 Lipofeetamine 2000 將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達載體與輔助包裝質粒共轉染如 293T 細胞進行病毒包裝。（ 5）收集、濃縮、純化和滴定重組LncRNA-ANCR腺病毒。2. 重組 LncRNA-ANCR腺病毒表達載體轉染大鼠BMS

9、Cs 的細胞學研究（ 1）大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs ）的分離、培養選取 2 月齡大鼠，無菌條件下獲取自體骨髓，用Ficoll 淋巴細胞分離液梯度離心法進行分離、培養，獲得自體原代骨髓干細胞，傳代培養。應用CD45 、 CD34 、CD29 、 CD105 單克隆抗體，FACS （流式細胞儀）檢測BMSCs 表面抗原表達。細胞分組：基因組： LncRNA-ANCR載體轉染的BMSCs無關序列組：無關序列載體轉染的BMSCs空載體組：空載體的BMSCs空白對照組：無特殊處理的BMSCs（ 3）檢測BMSCs 分化指標TaqMan RT-PCR 和 Western-blot 方法分別檢測各組

10、BMSCs 內 BMP7 mRNA 、Runx2 mRNA和 GDF5 mRNA以及相應蛋白表達3. 重組 LncRNA-ANCR腺病毒表達載體對大鼠DS 的動物實驗研究（ 1）實驗動物：剛斷乳的SD 大鼠 50 只，分 5 組，每組 10 只。（ 2）實驗分組：空白對照組：無特殊處理模型組：僅雙上肢截肢空載體組：雙上肢截肢+ 注射空載體轉染的BMSCs無關序列組：雙上肢截肢+注射無關序列載體轉染的BMSCs基因組：雙上肢截肢+注射 LncRNA-ANCR載體轉染的BMSCs（ 3）影像學觀察測量大鼠脊柱形態變化（ 4）病理學：觀察椎體和椎間盤病理變化（ 5）基因表達： TaqMan RT-PCR 檢測 BMP7 mRNA 、 Runx2 mRNA 和 GDF5 mRNA 表達（ 6）蛋白表達： Westernblot 檢測 BMP7 、 Runx2 和 GDF5 蛋白表達預期目標和意義：成功構建和鑒定重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體。將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體轉染到 BMSCs 細胞中，阻斷或顯著抑制B