1、匍匐莖克隆植物蛇莓的遺傳多樣性和遺傳結構收稿日期：2015-01-16基金項目：國家自然科學基金（編號：31200314、 31470475） ；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助（編號：20120014120001）。通信作者：羅芳麗，女，四川都江堰人，博士，副教授，主要從事濕地生態學研究。E-mail ： 。遺傳結構、 遺傳多樣性和生活史特征等影響物種與其所在環境間的相互作用，也決定物種的進化潛勢1 。繁育系統是決定植物種群遺傳結構的重要因素之一，而克隆植物一般兼具有性和無性2 種繁殖方式，且這2 種繁殖策略在一定程度上有權衡作用2-3 。

2、因此， 研究克隆植物的遺傳結構對深入了解植物種群遺傳多樣性的形成及進化機制具有重要意義4-5 ?？寺∩L是克隆植物所特有的生活史過程6 。很多克隆植物通過形成根狀莖、匍匐莖、鱗莖、珠芽、塊莖等，能夠迅速產生大量的無性后代個體即分株7 。除少數分株可能存在概率極低的遺傳突變以外，絕大多數分株的遺傳組成與親體分株（母株）完全相同8 。由于母株可通過克隆整合向后代分株提供光合產物、水分和養分的支持9-12 ， 使得這些后代分株能夠順利地度過建立期，并迅速占據局部空間，進而可能形成由1 個或幾個基因型占優勢的分株種群13-15 。這些生態過程對克隆植物種群遺傳結構和遺傳多樣性均可產生十分顯著的影響16

3、在自然界中，大多數克隆植物除了通過克隆生長進行無性繁殖之外，還能夠通過產生種子等進行有性繁殖8 。在 1 個或幾個基因型占優勢的分株種群中，由于相同基因型分株的大量存在， 使得相同基因型個體自交的概率極高，從而影響其遺傳多樣性水平 8-16 。 由于克隆植物的這些特性，人們最初普遍認為克隆植物種群的遺傳多樣性水平很低，遺傳結構簡單17 。 有研究表明，一些克隆植物的遺傳多樣性的確很低17-18 。例如，在全球范圍內，鳳眼蓮(Eichhornia crassipes )在非原產地的個體中約80%屬于同一個基因型14 ， 19-21 。中國南方地區的空心蓮子草(Alternanthera phil

4、oxeroides )很可能只存在1 個基因型 22 。 然而， 很多克隆物種具有與非克隆植物相當的遺傳多樣性如甜櫻桃( Prunus avium) 、 紅球姜 ( Zingiber zerumbet) 、大苦草(Vallisneria americana )和羊柴(Hedysarum laeve )等 23-27 。 這是因為與非克隆植物相比，克隆植物生命周期長，所以即使非常少量的實生苗(即種子萌發所產生的幼苗)更新也能使克隆種群維持較高的遺傳多樣性28 。蛇莓(Duchesneaindica Focke) 為薔薇科 ( Rosaceae) 蛇莓屬的多年生草本植物，主要分布在我國遼寧以南各省

5、(市、 區) ， 常生長在山坡、河岸、草地及潮濕的地方29 。 該物種通過產生較長的地上匍匐莖表現出旺盛的克隆生長習性。該物種也可通過有性生殖產生種子，并進一步萌發形成實生苗。蛇莓是一種典型的游擊型克隆植物，能夠快速形成單一基因型的大種群。該物種還具有較強的花展示，即能通過產生花蜜來吸引傳粉者，以增強有性繁殖30 。 近年來，對蛇莓的研究主要集中在化學活性成分、藥理， 克隆構型對環境的可塑性反應和小尺度克隆結構等方面31-33 。本研究采用簡單重復序列（simple sequence repeat ， SSR）分子標記技術對全國范圍內的33 個蛇莓野生種群的353 株個體的遺傳多樣性水平和遺傳

6、結構進行分析，旨在了解兼性克隆植物蛇莓的種群遺傳多樣性與遺傳分化，探討其遺傳結構的特點，具體回答以下科學問題： 克隆植物蛇莓種群的遺傳多樣性水平；蛇莓種群的遺傳多樣性主要發生在種群內還是種群間；蛇莓種群間遺傳距離與其地理距離的相關關系。1 材料與方法1.1 植物采集33 個蛇莓野生種群分別采自廣西、浙江、江西、湖南、貴州、河南、北京和陜西等10 個省（市、區），具體信息見表1和圖1。 每個種群根據面積大小各采集5 17 個樣本， 共 353 個，采集的植株在北京林業大學科技XX公司的溫室中進行培養備用。1.2DNA提取和PCR擴增根據CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（艾德萊生物，DN14

7、01，北京）的說明方法提取幼嫩蛇莓葉片中的總DNA，采用NAS-99分光光度計（ ACTGen，e 美國）確定總DNA的質量和濃度，并稀釋至10 ng/ L 備用。蛇莓SSR引物的開發由北京閱微基因技術XX公司完成，從中篩選出8 對清晰多態引物用于所有個體的PCR擴增，引物序列見表2。 PCR反應體系為：8 L 2.5 × Multiplex Buffer（ MRP1，7北京閱微基因技術XX公司，北京），0.4 L 15 mol/L TP-M13熒光接頭 （北京閱微基因技術XX公司） ， 2 L 引物 （ 5 mol/L ） ，0.2 L 5 U/ L Fast Taq DNA聚合酶

8、，2 L DNA模板，7.6 L無菌雙蒸水。PCR擴增程序為：95 預變性 5 min ； 94 變性30 s ， 56 退火 45 s ， 72 延伸 45 s ， 30 個循環；94 變性 30 s ， 53 退火 45 s ， 72 延伸 45 s ， 10 個循環；72 延伸 12 min 。 PCR擴增在9 600 PCR擴增儀（美國應用生物系統公司）上完成，PCR擴增產物在3 730 xl DNA 分析儀（美國應用生物系統公司）上進行基因分型分析。1.3 數據分析人工判讀PCR擴增產物的基因分型結果，記錄目的條帶的片段大小以構成SSR分子標記數據矩陣。使用 Popgen 32 軟件

9、34計算以下遺傳多樣性指數：每個位點的平均等位基因數（A）、預期雜合度（He）、Neis 基因多樣性指數（h）及 Neis 遺傳一致度和遺傳距離。計算實際基因型（即基株或克隆，所有位點基因型相同的植株為1 個基株）總數（G）、平均克隆大?。∟/G，基因型數/ 取樣個體數）、局部基因型（只存在于1 個群體中的基因型）比例（GL）、廣布基因型（存在于75%以上群體中的基因型） 比例 （ GW） 。 種群遺傳多樣性指數采用Simpson 指數 （ D） ，其計算公式為：D=1-ni（ ni-1） /N（ N-1 ） 。種群遺傳均勻性指數采用Fager指數（ E） 來表示， 計算公式為E（=D-Dmi

10、n）/（ Dmax-Dmin），其中Dmin =（ G-1） （ 2 N-G） /N（ N-1 ）， Dmax=（ G-1） N/G（ N-1）。式中N為取樣個體總數，G為基因型（基株）總數，ni 為第 i 基因型的個體數27 。使用 GenAlEx 6.5 軟件 35 計算種群間遺傳分化系數Fst，并進行分子方差分析（AMOV， A analysis of molecular varianceanalysis ），計算種群內和種群間遺傳方差分量。遺傳方差分量和成對種群遺傳分化系數的統計顯著性均采用9 999 次置換評價。為了檢測參試的蛇莓種群遺傳結構，采用STRUCTURE36分 析參試樣本

11、的遺傳結構。將MCMC（ markov chain monte carlo ）不作數迭代（length of burn-in period ）設為 1 萬次，不作數迭代后的MCMC也設為1 萬次，組群數（K）設定為2 33（參試種群數目），評價K值運行 20次。依據每次測試過程中計算的后驗概率lnP （ D）值計算 K值，繪制 K曲線圖。散點曲線最大值對應的K值視為最合理的組群數37 。使用 NTSYS 2.1 軟件 38 對種群間Neis 遺傳多樣性指數表2 蛇莓SSR引物序列引物序列（5 3）重復堿基片段大小統計量距離進行非加權平均配組（unweighted pair groupmetho

12、d with arithmetic-means ， UPGM）聚類分析，繪制樹狀 A聚類圖。利用GenAlEx 6.5 軟件中的Distance 計算 33個蛇莓野生種群間地理距離，Mantel 統計學分別檢驗分析種群間的地理距離和遺傳距離相關性，并進行顯著性檢測（9 999 次置換）。2 結果與分析2.1 種群遺傳變異和克隆多樣性選用 8 對能擴增出穩定、清晰條帶的SSR引物，對33 個蛇莓種群 353 株個體進行PCR擴增，共擴增出94 個等位基因，每個位點的等位基因數為7 23。蛇莓各種群的平均每個位點的等位基因數 （ A） 為 1.5 5， 平均 2.841 ； 期待雜合度（ He）

13、為 0.213 0.682， 平均 0.494； Neis 基因多樣性指數（ h） 為 0.465 0.640 ，平均 0.468 （表3）。蛇莓種群平均遺傳多樣性較高（A=2.841 ，He=0.494， h=0.468），其中，北京小龍門種群（XLM）的遺傳多樣性最高 （ A=4.55， He=0.682， h=0.640） ， 而江西九江種群（ JJ）的遺傳多樣性最低（A=1.5， He=0.213， h=0.199，表3）。蛇莓物種水平的遺傳多樣性也較高（ A=13.000， He=0.657， h=0.656） 。所有種群均為多克?。ɑ蛐停┓N群，克隆（基因型）總數為 223，各種群

14、的基因型數為2 15，平均6.758；克隆大小為1.0 7.5 ，平均 2.063；局部基因型比例為82.6%；廣布基因型比例為0； 平均基因型多樣性指數Simpson 指數為0.769（表3） 。2.2 種群遺傳結構SRUCTUR分析結果表明，E當 K=4時， K散點曲線呈穩定趨勢， 可推測出所有參試的353 株個體最合理的組群數為4（ 圖 2） 。圖 2 中縱坐標Q值表示不同植株歸屬于不同組群的比例，黑色 （組群）、深灰色（組群）、淺灰色（組群）和白色（組群）分別代表組群的趨向，每個個體在4 種顏色中最長色條的顏色決定該個體所屬的組群。組群包括FS、 GZ2、 HZ3、 JJ 和 SCH1

15、，組群包括LYW1、 LYW2、 LYW3、 LYW4、 SCH2、 SCH3、 TZ1、 TZ2、XA1、 XA2和 XLM，組群包括GZ1、 HZ1、 HZ2、 JAX、 JGS、 JGSU、JS、 NJ1、 NJ2、 NJ3、 GL1、 GL2和 GL3，組群包括CQ1、 CQ2、CQ3和 GZ3。基于種群間遺傳分化系數Neis 遺傳一致度指數的UPGM聚類結果（圖A3）表明，在遺傳分化系數以0.62為閾值的情況下，33 個種群可分為四大類，其中CQ1、 CQ2和 CQ3為第 1 個類群；GZ3為第2 個類群； HZ3和 JJ 為第 3 個類群；其他 27 個種群為第4 個類群。AMOV

16、A結果（表4）表明，蛇莓種群間遺傳變異約占總變異的 55%，種群內遺傳變異占總變異的45%，種群間遺傳分化顯著（ Fst=0.55 ， P=0.01 ） 。 成對種群間遺傳分化系數在0.020 0.464之間，各種群間遺傳分化達到顯著水平（P 0.25 時，遺傳分化較大 48 。蛇莓種群間Fst=0.547 ，由此可見蛇莓種群間存在較大的遺傳分化。種群遺傳分化系數是評價種群遺傳結構的重要參數， 植物種群遺傳結構一般解釋為交配系統、傳播方式、生活史、分布區大小等因素綜合作用的結果49-51 。與Nybom對 116種植物種群遺傳分化系數統計分析的平均值比較，蛇莓野生種群遺傳分化系數（ Fst=0

17、.55 ） 高于異交（0.27） ，低于自交（ 0.65 ），且高于混合交配（0.40）系統植物50 。說明蛇莓在進行克隆繁殖和克隆內自交繁殖外，還存在一定程度的異交，這可能是種群內不同基因型之間的基因交流或者不同種群間的基因交流，這與蛇莓是蟲媒花以及鳥類喜食其紅色聚花果并通過排泄散布可萌發的種子有關30 ， 52 ， 這與蛇莓兼性克隆繁殖和分布區較廣的生物學特征相符合。UPGM聚類結果表明，地理距離較近的種群則歸屬于同一類A群，同一?。ㄊ小^）的種群基本屬于同一類群，但也有例外，一些地理距離較近的種群沒有歸為同一類群，如北京房山（FS）和北京小龍門（XLM），四川簡陽市1（ SCH1）與四川

18、簡陽市2（ SCH3）和四川簡陽市3（ SCH2），以及杭州植物園2（ HZ3）與杭州其他2 個種群（HZ1 和 HZ2），另外貴州3 個種群分別屬于不同的類群。STRUCTUR分析結果也基本類似， E大部分同?。ㄊ小^） 種群都率先聚集在一起，然后再依地理距離由近到遠依次聚在一起，但是仍存在一些同?。ㄊ?、區）沒有優先聚在一起的種群，其中GZ3、 HZ3和 JJ 即為特殊的類群。比較STRUCTUR和 EUPGMA結果可知，33 個蛇莓野生種群的聚類大體一致，均可以分為 4 個組群。 說明蛇莓的遺傳距離與地理距離相關，但也有其特殊的復雜性。Mantel 分析發現，蛇莓的遺傳距離與地理距離的相關性不顯著。這些均與蛇莓沒有廣布基因型，且局部基因型占比（GL=82.6%）很高有關。葛頌等在兼性克隆植物羊柴（ Hedysarum laeve ）中也發現了類似結果，其局部基因型比例為 60%， 廣布基因型比例為3.2%。 這與 Ellstrand 等的總結一致，即克隆植物的大部分基因型都僅存在于1 個或很少的種群內40 。 這是因為克隆植物的遺傳基礎來源于建群者，并且在種群的發展