1、實驗一生活污水(含藥廠廢水)的細菌學檢查(綜合性實驗)實驗目的：1. 學習水樣的采取方法和水樣中細菌總數測定的方法2了解水源水的平板菌落計數的原則3了解PCR技術監測污染水體大腸埃希菌的意義和基本原理4 .掌握PCR操作技術實驗材料：1 .培養基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。2. 材料水樣3. 儀器及其他用具 恒溫培養箱、三角燒瓶，帶玻璃塞瓶，培養皿，移液器(1mL),移液管(1mL )，試管等，PCR儀，水浴鍋，培養箱，電泳儀，自動微量移液器(各型號)，濾膜，PCR管，離心管， Whatman 3MM濾紙或相當產品。4試劑及溶液 含有適當抗菌素的 LB培養基，Taq DNA聚合酶，正向引物(20

2、mol/L ) 及反向引物(20Mmol/L )溶于水中，DNA分子量標準，乙酸銨(IOmol/L ),無水乙醇，TSEL (50mmol/L Tris-HCl , pH8.0 , 20%蔗糖，50mmol/L EDTA , 1 乜/出 溶菌酶)，SSK (50mmo1/L NaCl, 1%SDS, 3mg/mL 蛋白酶 K),TE 緩沖液，10 x 擴增緩沖液(500mmol/L KCl , 100 mmol/L Tris-HCl , 15mmol/L , MgC1 2)°4種dNTP貯存液(20mmol/L , pH8.0 )，瓊脂糖溶液(0.7%),電泳緩沖液(1 x TAE)

3、，溴 化乙錠染色液，6 x凝膠上樣緩沖液。4. 儀器及其他用具實驗原理：本實驗采用平板菌落計數技術測定水中細菌總數。由于水中細菌種類繁多，它們對營養和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養基在一種條件下，使水中所有的細菌均能生長繁殖。因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌落計算得到的水中細菌總數僅是 一種近似值。目前一般是采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基測定水中細菌總數。大腸埃希菌(Escherichia coli )是指示糞便污染的重要指示物。當水體中出現大量的E.。PCRcoli就說明近期內水體受到了糞便污染(因其脫離寄主后，其半存留期會大大縮短) 檢測這種微生物非常靈敏，即使每 100

4、mL 水中只有一個個體，也能被檢驗出來。實驗內容：(一)細菌總數測定自來水(1) 用滅菌移液管或移液器吸取lmL 水樣，注入滅菌培養皿中。分別傾注約15mL已融化并冷卻到 45C左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，并立即在 桌上作平面旋搖，使水樣與培養基充分混勻。另取一空的滅菌培養皿，傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基15mL，作空白對照。(4)培養基凝固后，倒置于 37C溫箱中，培養24h,進行菌落計數。兩個平板的平均菌 落數即為 lmL 水樣的細菌總數。池水、河水或湖水等(1) 稀釋水樣：取3個滅菌空試管，分別加入9mL滅菌水。取lmL水樣注入第一管 9mL 滅菌水內、搖勻，再自第一管取 lmL 至下一

5、管滅菌水內，如此稀釋到第三管，稀釋度 分別為 10-1， 10-2 與 10-3。稀釋倍數看水樣污染程度而定，以培養后平板的菌落數在 30300 個之間的稀釋度最為合適，若三個稀釋度的菌數均多到無法計數或少到無法計 數，則需繼續稀釋或減小稀釋倍數。一般中等污染水樣，取10-1， 10-2,10-3三個連續稀釋度，污染嚴重的取 10-2， 10-3， 1 0-4三個連續稀釋度。(2) 自最后三個稀釋度的試管中各取1mL 稀釋水加入空的滅菌培養皿中。每一稀釋度做兩個培養皿。(3) 各傾注15mL己融化并冷卻至50C左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，立即放在桌上 搖勻。凝固后倒置于37 C培養箱中培養

6、24h.。菌落計數方法(1) 先計算相同稀釋度的平均菌落數。 若其中一個平板有較大片狀菌苔生長時， 則不應采用， 而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數。(2) 選擇平均菌落數在 30300 之間的，當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，則 以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數。(3) 若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30300之間，則按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小于 2，應采取兩者的平均數；若大于2，則取其中較小的菌落總數。(4) 若所有稀釋度的平均菌落數均大于 300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數。(5) 若所有稀釋度的平均菌落數均小于30,則應

7、按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數。 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30300之間，則以”近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數。(二)應用PCR技術監測污染水體大腸埃希菌1.水樣的處理及模板 DNA的制備(1)取水樣lmL ,低速(2 000 r/min )離心5min，以除去不溶性雜質。 取出上清，經6 000 r/min 離心5min，收集菌體。 將菌體懸于100 -IITSEL溶液中，置37C水浴作用30 min。 向反應混合物中加入 300川SSK溶液，置37 C繼續作用60 min。 向反應混合物中加入 2倍體積的無水乙醇，搖勻后置-20C, 2h. 12 000 r/min離心

8、15 min , 收集沉淀，室溫晾干后將沉淀物溶于100300川無菌去離子水或 TE緩沖液中備用。如果是純培養的菌落，即將菌落挑入100川無菌去離子水中，加熱煮沸lmin ,即可作為PCR模板。2引物設計本實驗的引物來自 E. coli的lac Z和lam B基因。lac Z 弓 I物 1 : ZL-1675 (5'-ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC-3' )引物 2: ZR-2025 ( 5'-GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA-3' )lam B 引物 1 : BL-4910(5'-CTGA TCGAATGGCTGCCAGGCTCC-3')引物 2: BR-5219 (5'-CAACCAGACGATAGTTA TCACGCA-3')3. PCR擴增體系按以下次序，將各成分加在0.5mL PCR薄壁管內混合：l0 X擴增緩沖液5120mmo1/L 4 種 dNTP 混合液(pH8.0) 1 丿120mo1/L正向引物2.5 720mo1/L反向引物2.5 7模板 DNA 510 JlTaq DNA聚合酶12單位補足H2O至總體積5014. PCR循環。依擴增產物按以下方法進行 PCR 擴增，典型的程序有變性、復性和聚