1、內容2021-12-221 背景介紹1 RNA干擾作用機制2 RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用3 問題及展望4一、背景介紹2021-12-222 RNA 干擾( RNA interference, RNA i) 是一種由短雙鏈RNA ( double-stranded RNA, dsDNA )所引起的序列特異性基因沉默, 是真核生物體內一種阻斷外源基因表達的自我防御體系, 是dsDNA 介導的,使與其互補的具有同源序列的單鏈RNA 進行特異性降解的過程。 RNA干擾(RNA interference ，RNAi)最早是由Mello和Fire等1998 年在線蟲體內發現。 RNAi 作為一種簡

2、單、高效的基因敲除工具，正在基因組學和疾病基因治療領域掀起一場革命，為腫瘤的基因治療提供了新思路，可能成為今后的腫瘤治療策略之一。二、RNA干擾作用機制2021-12-223轉錄水平轉錄后水平翻譯水平 RNA干擾的作用是在轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平等多個不同層次上實現的。三個水平轉錄后水平內源或外源的dsRNAdsRNA由核酸酶III (III (RNaseRNase III) - III) -DicerDicer在細胞內將dsRNAdsRNA均勻切割成小干擾RNA RNA ( (siRNAsiRNA),),長度約為2121- -23 23 ntnt。其中55端是磷酸端,3,3端常帶有突出

3、的非配對堿基( (多數是UU)UU)起始階段SiRNASiRNA結合一個核糖核酶復合物, ,形成RNARNA誘導沉默復合物(RISC)(RISC)，siRNAsiRNA雙鏈解旋，正義鏈釋放, , 激活RISC, RISC, RISCRISC識別靶mRNA, mRNA, siRNAsiRNA 反義鏈與mRNA mRNA 換位, , 在距siRNAsiRNA 3 3端12nt12nt處切割靶mRNA, mRNA, 從而實現對mRNA mRNA 的降解。效應階段 siRNA作為prime，特異性與靶mRNA結合,再次形成新的dsRNA，接著dsRNA再次被Dicer切割成siRNA,新形成的siRN

4、A為實現數量擴增的目的,進入下一輪循環,顯著抑制了對靶基因的表達。擴增階段2021-12-2242021-12-225轉錄水平2021-12-226 小分子干擾核糖核酸( siRNA)與互補DNA直接結合而發揮作用, 激發同源DNA 甲基化的加強, 使目的基因轉錄受限,表達關閉, 進而加強基因沉默。如果甲基化出現在啟動子區域, 則轉錄不能進行, 若甲基化出現在編碼區, 則轉錄進行, 但在轉錄后水平上沉默。翻譯水平2021-12-227 翻譯水平上的RNA i是抑制相應mRNA的翻譯, 使相應的蛋白質表達受阻, 其中起重要作用的是小時序RNA ( sm all temporal RNA,stRN

5、A ), 它是由長度約70 nt的RNA形成的莖環樣前體經dicer酶作用后形成長約21 23 nt的dsRNA, 通過R ISC結合在相應mRNA 的3 末 端非翻譯區上, 進而阻斷mRNA的翻譯。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-228（一） RNA干擾在腫瘤研究中的應用1.基因功能研究： 由于RNA 干擾能高效特異地阻斷基因表達，通過基因沉默機制作用于癌基因、抑癌基因表達，影響腫瘤生長，在體外培養細胞中研究靶基因的功能。因而成為研究基因功能很好的工具。例如：腫瘤易感基因篩查和鑒定，Williams 等通過結合cDNA 芯片技術和RNAi 技術鑒定了多個結腸癌高度相關基

6、因。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-2292.腫瘤發生機制研究: 設計多種小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）,可以產生多基因沉默的效果，用于細胞信號傳導通路的研究。Harvey 等用RNAi 技術抑制Brk 蛋白表達，結果發現乳腺癌細胞的增生受到抑制。同時還發現Brk的無激酶活性突變體，可以接合器的形式，通過非激酶依賴的機制，促進腫瘤細胞的生長。結果表明Brk 可作為乳腺癌治療的新目標。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-2210（二） RNA干擾在腫瘤治療中的應用1.不同siRNA 之間的增效作用 由于腫瘤是一種多基

7、因調控的疾病，采用 RNA干擾技術對腫瘤相關基因進行多重抑制會產生更好的療效。邵榮光針對不同的腫瘤相關基因，設計合成了靶向bcl-2、cdk-2、mdm-2、H-ras、pkc- 的siRNA, 這些siRNA 各自都能抑制黑色素瘤細胞的增殖，其抑制率分別為68%、64%、72%、74%和53%。當5 種siRNA 聯合應用時，能顯著提高復合siRNA 對黑色素瘤細胞的抑制作用。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-22112.SiRNA對靶分子藥物具的增效作用 表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑埃羅替尼（erlotinib）被批準在臨床上應用，但大多數晚期肺癌患者不應答, 早

8、期肺癌患者總是發展為耐藥性,占一半的復發患者T790M-EGFR 基因發生了突變。研究證明，領用RNA干擾技術敲除肝細胞生長因子受體（MET）和表皮生長因子受體（EGFR），能顯著的促進埃羅替尼耐藥的H1975 細胞凋亡。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-22123.siRNA 對DNA 損傷劑的增效作用 5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羥基喜樹堿為兩種常用的抗腫瘤藥物，研究證明，Bcl-2/Bcl-xl siRNA 轉染細胞對5-FU (5-氟尿嘧啶) 或羥基喜樹堿表現出更高的敏感性，提示Bcl-2/Bcl-xl siRNA 介導的基因沉默結合化療藥物可能是潛在的人肝癌治療

9、策略。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-22134. siRNA 對放療的增敏作用 MDM2 蛋白被證明在輻射應答和腫瘤放射敏感性方面發揮關鍵作用, 是一個有吸引力的臨床藥物靶標, 利用RNA干擾技術抑制MDM2 可以加強腫瘤對放射治療的敏感性。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-2214 5.抗腫瘤新藥研發 利用RNAi特異性地抑制癌細胞內的內源性致癌基因的表達,而不影響正常細胞的基因表達,在研究腫瘤發生發展的信號通路以及表型變化可以發揮極大的作用,從而可以進一步為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點。siRNA從發現到現在的短十幾年時間內,很多研究工作

10、者、生物技術公司和制藥公司己經開始廣泛利用siRNA藥物治療腫瘤。 2008年,美國Calando Pharmaceuticals公司祀向核糖核苷酸還原酶M2亞基(M2 subunit of ribonucleotide reductase, RRM2)取得了突破性的進展,申請的治療實體腫瘤的siRNA藥物CALAA-01被美國H)A批準進入臨床試驗I期,成為最早siRNA藥物治療癌癥的首例臨床試驗。 三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-2215 2009年7月,德國著名制藥公司Silence Therapeutics公司開展了治療實體腫瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干

11、擾藥物Atu027的I期臨床試驗,2011年,該公司報道了其進展,資料顯示,24名患者經過Atu027多次治療后,有9名患者病情穩定,6名患者的較好療效表現在研究終點(治療3個月),另外3名患者還在接受治療,目前的結果還比較令人滿意。 2010年12月,加拿大Tekmira制藥公司宣布開始siRNA藥物TKM-080301(靶向腫瘤細胞高表達的polo樣激酶I (polo-like kinase I, Plkl)的I期臨床試驗。目前臨床前研究證明TKM-080301能特異性地殺死腫瘤細胞,而對正常細胞無明顯毒副作用,對肝癌以及肝外腫瘤都有很好的抗腫瘤效果。 三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應

12、用2021-12-2216（三）RNA干擾技術在腫瘤治療方面的優勢 與基因替代、反義核苷酸治療、細胞因子基因治療方法相比，RNAi 技術有著無可比擬的優勢。1.RNAi 基因抑制效果確切：微量的siRNA 即可使其編碼致病基因產物的含量下降90%以上。因此，注入少量的siRNA 足以產生強大的干擾效應，減少了傳統基因治療方法大劑量用藥帶來的毒副作用及免疫效應。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-22172. RNAi 抑制具有嚴格的序列特異性，將一段與基因同源的siRNA 注入細胞，它可以特異性地干擾相應基因的表達，其他基因即使與靶基因同屬于一個基因家族也不會受到干擾。因此，

13、RNAi 干擾治療的針對性很強，副作用小。3.腫瘤是多基因、多因素疾病，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制腫瘤的生長，傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNAi 可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的dsRNA 分子，只注射一種dsRNA 即可以剔除多個基因，也可以同時注射多種dsRNA 而將多個序列不相關的基因同時剔除，而且抑制效果互補干擾。四、問題及展望2021-12-2218（一） RNA干擾技術在腫瘤治療方面要克服的問題理論上只有在siRNA和靶mRNA特異性結合才會沉默靶基因表達。脫靶效應在疾

14、病治療上存在潛在的危險。由拖把效應產生的意外的基因調控成為RNAi技術治療的一個主要障礙。一些研宄工作者發現,由于siRNA的特殊結構、序列以及藥物釋放方式,會引起人體強烈的先天免疫反應,刺激干擾素和炎癥細胞因子等化學物質的釋放。由于siRNA本身穩定性差,穿透細胞膜的能力差,無靶向功能,在生理環境中極不穩定,易被血清中的酶迅速降解,被肝臟和腎臟清除,因此如何siRNA體內給藥以及開發siRNA輸送體系是siRNA療法的最大挑戰。免疫刺激系統給藥脫靶效應四、問題及展望2021-12-2219（二） 展望 RNA i技術已經引起了實驗生物學的巨大變革, 在腫瘤治療, 它可以單獨應用，也可以與藥物

15、等其它治療手段聯合應用。隨著研究的深入， RNA干擾技術將日漸成熟并運用于更廣更多的領域。隨著新的小分子RNA的不斷出現及人們對RNA干擾機制的深入研究和 干擾技術的不斷完善，RNA干擾有望成為抗腫瘤的最新方法。相信不久的將來， RNA干擾技術將會逐漸完善，必將探索出一條攻克惡性腫瘤的新路。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-22204. siRNA 對放療的增敏作用 MDM2 蛋白被證明在輻射應答和腫瘤放射敏感性方面發揮關鍵作用, 是一個有吸引力的臨床藥物靶標, 利用RNA干擾技術抑制MDM2 可以加強腫瘤對放射治療的敏感性。三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-

16、12-2221 5.抗腫瘤新藥研發 利用RNAi特異性地抑制癌細胞內的內源性致癌基因的表達,而不影響正常細胞的基因表達,在研究腫瘤發生發展的信號通路以及表型變化可以發揮極大的作用,從而可以進一步為腫瘤的早期診斷和后期治療找尋新的靶點。siRNA從發現到現在的短十幾年時間內,很多研究工作者、生物技術公司和制藥公司己經開始廣泛利用siRNA藥物治療腫瘤。 2008年,美國Calando Pharmaceuticals公司祀向核糖核苷酸還原酶M2亞基(M2 subunit of ribonucleotide reductase, RRM2)取得了突破性的進展,申請的治療實體腫瘤的siRNA藥物CALAA-01被美國H)A批準進入臨床試驗I期,成為最早siRNA藥物治療癌癥的首例臨床試驗。 三、RNA干擾在腫瘤研究及治療中的應用2021-12-2222 2009年7月,德國著名制藥公司Silence Therapeutics公司開展了治療實體腫瘤的靶向蛋白激酶PKN-3基因RNA干擾藥物Atu027的I期臨床試驗,201