1、第一二章遺傳物質的分子本質基因工程:分、切、接、轉、篩遺傳物質的發現：肺炎雙球菌的體內轉化實驗（格里菲斯）（a）將光滑型肺炎雙球菌注入小鼠體內，使小鼠致死。（b）將粗糙型肺炎雙球菌注入小鼠體內，對小鼠無害。（c）將光滑型肺炎雙球菌加熱殺死后，再注入小鼠體內，對小鼠無害。（d）將加熱殺死的光滑型肺炎雙球菌與粗糙型肺炎雙球菌一起注入小鼠體內，小鼠死掉。結論：加熱殺死的S型細菌中，含有某種促成R型細菌轉化為S型細菌的“轉化因子”肺炎雙球菌的體外轉化實驗艾弗里及同事取S型細菌，分離出其中的DNA，蛋白質，多糖以及將DNA與DNA酶混合，將以上四組分分別于R型細菌培養基混合培養；結果除有DNA組的培養液

2、中既能分離出R型細菌又能分離出S型細菌，其余各組均只有R型細菌。結論：只有DNA才是使R型細菌產生穩定遺傳變化的物質。DNA作為遺傳物質的證實：噬菌體侵染細胞的實驗用放射性同位素35S標記蛋白質，32P標記DNA，用標記的噬菌體感染細菌，發現只有標記的DNA進入細菌細胞內，而標記的蛋白質留在細胞外。結論：DNA是遺傳物質。證明DNA的半保留復制將大腸桿菌放在15N為唯一氮源的培養基上連續培養，使細胞內的DNA兩條鏈上的14N被15N取代，收集菌體，一部分用于抽取DNA，一部分放在14N為氮源的培養基中繼續培養一代，一部分提取DNA，另一部分繼續培養，再提取DNA,用CsCl密度梯度離心的方法，

3、發現0代為一條高密度帶，兩條鏈上的N原子全部是15N，第一代為中密度帶，第二代中有中密度帶和低密度兩條帶。DNA的提取：1. 細胞裂解2. 去除蛋白等雜質（酚：氯仿：異戊醇25:24:1）3. 沉淀DNA（乙醇，異丙醇）4. 風干DNA5. 溶解DNA細胞破碎：機械方法：超聲波處理法、研磨法（植物葉）勻漿法（動物組織）； 化學試劑法：用SDS、CTAB（植物組織）； 酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。DNA的測序：Sanger的雙脫氧終止法核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈

4、就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續延長。如此每管反應體系中便合成以共同引物為5端，以雙脫氧堿基為3端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個堿基），根據片段3端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。PCR技術（聚合酶鏈式反應）原理：雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。反應條件：Taq酶，dNTP,Mg離子，引物，模板過程：變性，退火，延伸核酸的分子雜交（Southern印記雜交）原理：具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補

5、配對原則退火形成雙鏈的過程。步驟：（一）待測核酸樣品的制備1、 裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段（二）待測DNA樣品的電泳分離（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉移到一定的固相支持物上的過程（五）Southern雜交 1、預雜交：封閉膜上能與DNA結合的位點預雜交液為不含DNA探針的雜交液2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交3、洗膜：去除游離的放射性探針或

6、非特異結合的DNA（六）雜交結果檢測1、放射自顯影2、比色或化學發光檢測第三章 基因、基因組及基因組學基因：是DNA分子上具有特定功能的(或具有一定遺傳效應的)核苷酸序列，是遺傳的基本單位。（有編碼序列和非編碼序列兩部分；后者包括調控序列、內含子及編碼區兩端的序列）轉座成分or 移動基因:是一些可以在染色體基因組上從一個位置轉移到另一個位置，甚至在不同染色體之間躍遷的DNA成分。有人將之形象地稱為跳躍基因。（Ac/Ds因子）Ac-Ds系統 玉米糊粉層顏色的控制涉及多對相關基因。C基因為野生型時，胚乳呈紫色，若C基因突變為c阻斷了紫色素的合成，那么胚乳為白色。在胚乳發育過程中，若突變發生回復則導

7、致產生斑點，回復突變發生得越早，產生的紫斑就越大，發生得越晚，則產生的紫斑就越小。McClintock認為突變基因c(無色)是由一個可移動的"控制因子(controlling element)"(現稱轉座子)引起的，稱為解離因子(dissociator，Ds)，它能合成轉座酶，它可以插入到基因C中，即轉座。另一個可移動的控制因子是Ac，稱激活因子(Activator)，它的存在可以激活Ds轉座進入C基因或別的基因，也能使Ds從基因中轉出，使突變基因回復。這就是Ac-Ds系統。斷裂基因：在編碼序列中間插有與氨基酸編碼無關的DNA間隔區，這些間隔區稱為內含子；而編碼區則稱為外顯

8、子。含有內含子的基因稱為不連續基因或斷裂基因。（內含子并非都含而不顯，外顯子并非都顯）假基因：是一些核苷酸序列與其相應的正常功能基因基本相同、但卻不能合成出功能蛋白質的失活基因。（人類珠蛋白）重疊基因：核苷酸序列是彼此重疊的的基因稱為重疊基因或嵌套基因。基因按其產物的功能可分為結構基因、調控基因和RNA基因。結構基因：可被轉錄形成mRNA，并進而翻譯成多肽的基因。調控基因：指某些可調節控制結構基因表達的基因。RNA基因：是一些只轉錄不翻譯的基因，包括核糖體RNA基因，專門轉錄rRNA；以及tRNA基因，專門轉錄tRNA。C值：生物體的單倍體基因組所含DNA總量稱為C值。C值矛盾：生物體的復雜性

9、與DNA含量并不總是正相關。N值矛盾：生物體的復雜性與基因數之間并不總是正相關。原核生物的基因組包括兩類DNA分子，染色體攜帶細胞生存和繁殖所需的全部遺傳信息，質粒染色體以外獨立存在的DNA分子。操縱子(operon)：功能上相關的幾個結構基因前后相連，由一個共同的調節基因和一組共同的控制位點，即啟動子(promoter)和操作子(operator)對其表達過程實行協同調節控制。細菌基因表達調控的這樣一個完整的單元，稱為操縱子。質粒DNA：細菌細胞內一種自我復制的環狀雙鏈DNA分子，能穩定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。現在常用的質粒大多數是經過改造或人工構建的，

10、常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術中重要的工具。基因家族：真核生物基因組中，來源相同、結構相似、功能相關的一組基因。如人類珠蛋白和類珠蛋基因家族。根據基因家族成員的分布形式不同，基因家族分為：基因簇和散布的基因家族基因簇：基因家族的各成員緊密成簇排列成大段的串聯重復單位，定位于染色體的特殊區域。它們是同一個祖先基因擴增的產物。如人類類鏈基因簇和類鏈基因簇。散布的基因家族：基因家族成員在DNA上無明顯的物理聯系，甚至分散在多條染色體上。如肌動蛋白基因家族和微管蛋白基因家族。重復基因：染色體上大量無轉錄活性的重復DNA序列家族，主要是基因以外的DNA序列。重復基因有兩種組織形式：串聯重復序列和散

11、布的重復序列根據重復單位的大小，重復基因可分為衛星DNA；小衛星DNA；微衛星DNA 衛星DNA：有些高度重復DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有區別，在浮力密度梯度離心時，可形成不同于主DNA帶的衛星帶，此類DNA稱為衛星DNA。散布的重復序列：短散布元件（Short interpersed element, SINE；長散布元件（Long interpersed element, LINE）細胞器基因組絕大多數為環狀，少數低等真核生物為線性分子。第四章 DNA的生物合成 DNA復制的基本特點：模板，dNTP, Mg2+，解鏈，半保留復制，需引物，復制方向53，起始特定區域，終止區不

12、固定，方向一般為雙向，半不連續，高度忠實性。與DNA復制有關的酶、蛋白質：DNA聚合酶、DNA解鏈酶、單鏈結合蛋白、DNA引發酶、DNA拓撲異構酶、DNA連接酶和端粒酶。所有DNA聚合酶、 RNA聚合酶的三維結構都相似，由finger、palm、thumb（手指、手掌、拇指）三個結構域組成。原核生物DNA pol E.coli DNA 聚合酶: DNA pol I；DNA pol II；DNA pol III；DNA pol IV；DNA pol V DNA pol I具有53聚合酶活性 5核酸外切酶活性（切除DNA5端的RNA引物） 3核酸外切酶活性（自我校對）Hans Klenow 用蛋白

13、水解酶水解DNA pol I 的323-324位，得到兩個片段：大片段：75kd，605aa聚合酶活性（大）35核酸外切酶活性（小）；小片段：36kd，323aa 53核酸外切酶活性。DNA聚合酶53外切活性切口平移的功能用于制備探針！DNA pol II有53聚合酶活性 35核酸外切酶活性DNA pol III：多亞基；聚合酶活性是DNA pol I 的 50 倍；50,000base/min；10-20分子/cell；有35 核酸外切酶活性； 無53核酸外切酶活性；高進行性；真核生物DNA pol DNA pol a : 引物合成 DNA pol b : DNA repair DNA po

14、l g : 線粒體 DNA合成 DNA pol d : DNA pol III DNA pol e : DNA pol I半不連續復制是指DNA復制時，前導鏈上DNA的合成是連續的，后隨鏈上是不連續的脈沖標記實驗：以E.coli為材料，在培養時，培養基中加入同位素3H標記的 dNTP，經30秒后，DNA剛開始復制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來確定片段的大小，再檢測放射標記，結果表明被3H標記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數為20S左右，即都是長10002000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大2050倍；第二組實驗是

15、脈沖追逐實驗，先進行標記培養30秒，以后除去同位素繼續培養幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測結果為較長的片段。剛開始合成的片段都是短片段，以后再連接成長片段。前導鏈上的合成是連續的，只有后滯鏈上的合成才是半連續的。端粒：真核細胞內線性染色體末端的一種特殊結構，由DNA簡單重復序列以及同這些序列專一性結合的蛋白質構成。端粒酶：一種反轉錄酶，由蛋白質和RNA兩部分組成核糖蛋白復合體，其中RNA是一段模板序列，指導合成端粒DNA的重復序列片段。端粒的功能：穩定染色體末端結構，防止染色體間末端連接，并可補償滯后鏈5'末端在消除RNA引物后造成的空缺。DNA復制的高度忠實性（1） 四種脫氧核苷

16、三磷酸濃度的平衡（2） DNApol的高度選擇性（3） DNApol的自我校對（4） 錯配修復（5） 使用RNA作為引物第六章 DNA 重組DNA重組：發生在DNA分子內或分子間核苷酸的交換、重排和轉換現象，是已有遺傳物質的重新組合。重組的生物學功能:產生新的基因/等位基因的組合（在減數分裂交換期間）產生新的基因（如抗體基因的重排） 特定的DNA元件的整合DNA修復 重組原理的應用用于染色體上的基因作圖（重組頻率與基因之間的距離相關）培育轉基因細胞和生物重組的類型：同源重組 位點特異性重組 轉座重組 1.同源重組 發生在近乎相同的序列之間（如在減數分裂），只依賴序列的同源性2.位點特異性重組發

17、生在具有一定相似性的序列之間，涉及特異性位點3.轉座重組DNA元件從一個位點轉移到另一個位點，通常沒有序列的特異性同源重組：它發生在含有同源序列的兩個DNA分子之間，即在兩個DNA分子的同源序列之間直接進行交換。進行交換的同源序列可能是完全相同的，也可能是近乎相同的。細菌的接合、轉導、轉化和真核細胞的同源染色體之間的交換等都屬于同源重組。同源重組機制-Holliday模型 過程：（1）兩個同源的DNA相互靠近（2）兩個DNA分子在相同的位置被一種特異性的內切酶切開 （3）被切開的鏈交換和連接形，中間物稱為Holliday中間物或Holliday連接.Holliday模型的特點：兩個DNA分子上

18、各有1條鏈在對應的位置發生兩次斷裂，有分支遷移。如果第二次斷裂點和第一次斷裂點在同一條鏈，則結果為非重組型DNA，如果第二次斷裂點是在另外一條鏈上，則結果為重組型DNA。參與重組的主要蛋白RecA參與大腸桿菌所有的同源重組途徑，有單體和多聚體兩種形式。RecA的主要功能包括兩個完全不同的活性：（1）促進2個DNA分子之間鏈的交換；（2）促進LexA 阻遏蛋白的自我水解（DNA修復）原理： RecA初級位點與單鏈DNA結合，* RecA的次級位點與1個雙鏈DNA分子結合，* RecA催化鏈交換。RecA蛋白促進2個雙鏈DNA分子鏈之間的交換同時滿足三個條件 ：（1） 兩個DNA分子中的一個必須含

19、有單鏈區域，以便于RecA能夠結合（2） 兩個DNA分子必須含有不低于50bp的同源序列（3） 同源序列內必須含有一個自由的末端，以啟動鏈的交換RecA蛋白參與同源重組的具體步驟：（1） 聯會前階段 RecA通過它的第一個DNA結合位點與單鏈DNA結合，包被DNA，形成蛋白質-DNA絲狀復合物（2） 聯會階段 RecA通過它的第二個DNA結合位點與一個雙鏈DNA分子結合，形成3鏈DNA中間體，隨后單鏈DNA侵入雙鏈DNA，尋找同源序列。（3） 鏈交換階段 由被RecA包被的單鏈DNA從53方向取代雙鏈DNA分子中的同源老鏈，形成異源雙鏈，并發生分叉遷移。大腸桿菌幾種重要的同源重組途徑：1） R

20、ecBCD途徑 這是大腸桿菌最主要的重組途徑。除了RecBCD以外，還需要RecA、SSB、RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶I、DNA 連接酶和DNA旋轉酶。此外，還需要chi序列。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三個亞基組成。 具有5種酶的活性外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶。RecBCD蛋白的作用模型RecBCD與雙鏈DNA分子自由末端結合，依靠ATP的水解為動力，延雙鏈移動，解開雙鏈，但它在上面一條鏈比在下面一條鏈移動的速度要快，于是一個單鏈的環形成了，這種環隨著它沿DNA雙鏈的移動而增大，先是依靠它的3外切酶活性降解上面的一條鏈。一旦

21、遇到序列，3外切酶活性減弱，而5外切酶活性被激活，于是下面一條的單鏈部分被迅速降解水解，留下上面一條鏈的單鏈部分。產生的單鏈DNA，為RecA作用的底物，由此啟動了鏈的交換和重組反應。RecBCD結合在雙鏈斷裂，RecBCD解鏈并作為外切酶降解DNA，RecBCD停留在chi處，內切酶切開單鏈RecD在chi順序解離RecBC繼續作為解鏈酶 （2）RecF途徑 這主要是質粒之間進行重組的途徑，需要的蛋白質有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等。（3）RecE途徑位點特異性重組是指在DNA特定位點上發生的重組，它需要專門的蛋白質識別發生重組的特異性位點并催化重組反應。位點特

22、異性重組也發生鏈交換、形成Holliday結構、進行分叉遷移和Holliday結構解離。位點特異性重組可以發生在2個DNA分子之間（發生整合），也可以在1個DNA分子之內（發生缺失或倒位）。位點特異性重組的功能包括：（1）調節噬菌體的整合；（2）調節基因表達；（3）調節胚胎發育期間程序性的DNA重排。轉座重組：DNA上的核苷酸序列從一個位置轉位或跳躍到另外一個位置的現象。發生轉位或跳躍的核苷酸序列被稱為轉座子或可移位的遺傳元件。（與同源重組和位點特異性重組不同的是，轉座子的靶點與轉座子并不存在序列的同源性。接受轉座子的靶位點可能是隨機的，也可能具有一定的傾向性，這與轉座子本身的性質有關。）原核

23、生物的轉座子的類型及特點：插入序列（IS）；復雜型轉座子；復合型轉座子（TnA家族）；Mu噬菌體插入序列（IS）能夠從DNA的一個位點插入到另一個位點，導致靶位點基因以及和靶位點基因在同一個操縱子內，但位于靶位點基因下游的基因表達受阻稱為極性效應。極性效應：上游基因的敲除或插入導致其下游基因表達受阻的現象。IS：1）較小，長度一般在700bp -1800 bp之間；（2）絕大多數兩端含有10bp-40bp長的反向重復序列；（3）通常內部只有一個基因，編碼的蛋白質是專門催化轉位反應的轉座酶（tnpA），沒有任何抗生素或其它毒性抗性基因；（4）通過“剪切”和“粘貼”的方式進行轉座，轉座結束后可導致

24、插入點序列重復。（5）有少數IS，沒有明顯的反向重復序列，它們是通過復制（滾環復制）與粘貼的方式進行轉座的。 復雜型轉座子：（1）長度較長；（2）兩側含有較長的反向重復序列；（3）內部含有一個或幾個結構基因。常見的結構基因有：轉座酶基因tnpA，解離酶基因tnpR和抗生素抗性基因。（4）轉座完成以后可導致約5 bp長的靶位點序列加倍，從而在轉座子兩側產生直接重復序列。復合型轉座子：2個IS（同向或反向均可）插入到功能基因（抗生素或其它毒性抗性基因）兩端，形成復合型轉座因子。每個IS（作為第一類轉座子）可以獨立轉位，也可以與插入的功能基因作為整體一起轉位。Mu噬菌體：兩側無反向重復序列，基因組有

25、20多個基因，但只有A基因（編碼轉座酶）和B基因（與復制和轉座有關）與轉座有關聯。在轉座的過程中，可引起靶位點序列重復。在溶源狀態下，它能在宿主DNA的不同位置間隨機轉移。由于Mu轉移的靶位點不固定，很容易造成宿主細胞的各種突變，其名稱與它的誘變子角色有關。 轉座機制類型 (1) 復制型轉座(2) 非復制型轉座(3) 保守轉座真核生物轉座子的類型及特點真核生物的轉座子類型：Ac-Ds系統，果蠅的P元件，“水手”元件，MITE；酵母的Ty元件，果蠅的copia元件，LINE和SINE等轉座的分子機制：簡單轉座、復制型轉座真核生物轉座的分子機制：簡單轉座（“剪切”和“粘貼”機制 ），復制型轉座（“

26、復制”和“粘貼”機制）第七章 DNA轉錄-RNA生物合成模板鏈（無意義鏈，Watson鏈）可作為模板轉錄為RNA的那條鏈，該鏈與轉錄的RNA堿基互補。另一條鏈稱為該基因的編碼鏈（有意義鏈，Crick鏈）。原核生物RNA聚合酶的結構與功能所有的三類RNA由同一種RNA聚合酶催化大腸桿菌的RNA聚合酶大小為465 kD，含有2 , 1, 1, 1, 1亞基。 全酶2 核心酶： 2 全酶由核心酶和因子組裝而成。抑制劑：利福霉素和利鏈霉素因子具有兩個功能：(1) 降低酶對非特異性DNA序列的親和性。(2) 大大提高酶對啟動子序列的親和性。(70正常生長(主要的),32熱休克(應急條件下),60N饑餓(

27、應急條件下)全酶的結構與功能:結合DNA ，結合NTPsb和 一起構成活性中心，a聚合酶的組裝，轉錄的起始，與調節蛋白的相互作用，轉錄的起始和延伸，它們也能結合 DNA. r識別啟動子序列。真核細胞的細胞核具有三種RNA聚合酶:RNA聚合酶I(A)：細胞核內的rRNA（5S rRNA除外）RNA聚合酶II(B) mRNA snRNARNA聚合酶III(C)小分子RNA（tRNA和5SrRNA）除此以外，線粒體和葉綠體也含有RNA聚合酶。-鵝膏蕈堿是真核生物RNApol抑制劑 。RNA pol詳細的三維結構：鉗、翼、舵、拉鏈、次級通道、離開通道（p163）啟動子是位于結構基因5'端上游的

28、DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確的結合并具有轉錄起始的特異性。 啟動子包括兩段一致序列： “-35 區” 、“-10 區增強元件：在某些轉錄活性超強的rRNA基因的上游40和60之間的區域，富含AT的序列，可將轉錄活性提高30倍。轉錄的起始：RNA聚合酶與啟動子相互作用并形成活性轉錄起始復合物的過程，整個反應可分為以下幾步：RNA聚合酶與dsDNA非特異性結合；RNA 聚合酶全酶與啟動子形成封閉復合物；封閉復合物異構化，轉變成開放復合物；第一個磷酸二酯鍵形成 ；啟動子清空 細菌基因轉錄起始過程中開放復合物的形成 見右圖轉錄的延伸當RNApol合成了大約十聚核苷酸的時候延伸開

29、始，這時轉錄物的長度足以讓RNA取代因子，失去因子的核心酶通過松散的“滑動鉗”構象握住DNA，以更快的速度沿著模板鏈向前推進。轉錄泡則隨著核心酶的移動而移動，其大小維持在17 bp左右。轉錄泡的維持不僅需要聚合酶在轉錄泡前面解鏈以使新的模板鏈序列得以暴露，而且還要允許轉錄泡后面的DNA重新形成雙鏈。解鏈形成的超螺旋可被結合在轉錄泡前面的拓撲異構酶解除。由于轉錄的方向始終是從53，新參入的核苷酸總是被添加在RNA鏈的3-OH端。每參入一個新的核苷酸，RNA-DNA雜交雙鏈必須發生旋轉。轉錄的終止兩種機制：依賴于因子的終止；不需要因子，但需要RNA轉錄物3-端一段被稱為終止子的序列。不需要因子的轉

30、錄終止：RNA聚合酶到達終止子的時候暫停，發夾結構形成，發夾結構破壞了RNA聚合酶和它的RNA產物之間的作用，富含U-的序列很容易與模板鏈解離，轉錄復合物解體，轉錄終止.依賴于因子的終止：轉錄復合體通過因子輔助，特異性識別自身合成RNA的富含胞苷和少含鳥苷的區域與莖-環區相連結構為轉錄終止信號，并從模板DNA解離釋放的過程。 真核生物DNA轉錄啟動子包括核心啟動子和上游控制元件（UCE）轉錄終止需要一種特異性的DNA結合終止因子 mRNA的基因轉錄受到多種順式作用元件的控制，包括核心啟動子、調控元件、增強子和沉默子。核心啟動子包括：TATA盒、起始子（Inr）、TFIIB識別元件（BRE）、下

31、游啟動子元件（DPE）和GC盒。上游控制元件：在啟動子上游存在的TATA框,CAAT框和多個GC框,它們均對啟動子的啟動過程起調控作用。順式作用元件：在同一條核苷酸鏈上起調控基因作用的核酸序列弱化子：RNA合成終止時，起終止轉錄信號作用的那段DNA序列。沉默子：是一種抑制基因表達的順式作用元件第八章 轉錄后加工基因轉錄的直接產物被稱為初級轉錄物。初級轉錄物一般是無功能的，它們在細胞內必須經歷一些結構和化學的變化即所謂的轉錄后加工以后才會有功能。RNA后加工主要有：增減某些氨基酸、修飾某些氨基酸真核細胞mRNA前體的后加工加工形式 1) 5-端 = 加帽2) 3-端 = 加尾3) 內部 = 剪接

32、4) 內部=甲基化 5) 編碼區=編輯加帽和甲基化:帽子結構和類型 0、I和 II型,加帽反應：共轉錄1) 酶,磷酸水解酶；mRNA鳥苷酸轉移酶；鳥嘌呤-7-甲基轉移酶 2) 步驟開始于mRNA 5-三磷酸的 磷酸根水解,留下的5-二磷酸進攻GTP，與GMP形成共價交聯，同時釋放出PPi.鳥嘌呤隨后在N7位置被甲基化，甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸為什么要有帽子？提高mRNA的穩定性參與識別起始密碼子的過程，提高mRNA的可翻譯性有助于mRNA通過核孔從細胞核運輸到細胞質提高剪接反應的效率。帽子結構的功能:(1)有助于mRNA越過核膜，進入胞質； (2)保護5不被酶降解； (3)翻譯時供IF（起始

33、因子）和核糖體識別。為什么只有mRNA加帽?之所以只有mRNA和某些snRNA才有帽子結構，是因為它們都由聚合酶II催化，當TFIIH磷酸化CTD重復序列后，它即可以將轉錄因子DSIF 招募到轉錄復合物，而新加入到復合物之中，DSIF隨后將另外一種轉錄因子NELF招募進來，以阻滯轉錄。上述暫停允許加帽酶進入，來修飾轉錄物的5-端。第三種轉錄因子P-TEFb是一種激酶，在帽子結構形成不久也被招募到復合物，然后磷酸化CTD的Ser2和NELF，NELF隨之失活，聚合酶II繼續延伸。為什么必須有尾巴？保護mRNA免受3-外切核酸酶的消化，提高mRNA的穩定性。PABP能夠與帽子相互作用增強mRNA的

34、可翻譯性，提高其翻譯的效率；影響最后一個內含子的剪接；某些本來缺乏終止密碼子的mRNA通過加尾反應創造終止密碼子。在UG后加尾可產生UGA，在UA后加尾產生UAA；通過選擇性加尾調節基因的表達。核酶：是指本質為RNA或以RNA為主含有蛋白質輔基的一類具有催化功能的物質。GU-AG規則RNA內含子序列 5' 端 的起始兩個核苷酸總是 5'-GU-3' ，并且其 3' 端 的最后兩個核苷酸總是 5'-AG-3' 。左邊的剪接位點稱供體（donor）位點，右邊的剪接位點稱受體（acceptor）位點。mRNA前體的剪接機制 ：mRNA前體的剪接是高度精

35、確的。其精確性一方面取決于位于外顯子和內含子交界處的剪接信號（可以將其視為內因），另外一方面取決于5種被稱為snRNP（核內小核糖核蛋白）的核糖核酸蛋白質復合物（可以將其視為外因）。剪接反應的“內因”剪接信號剪接反應的“外因”snRNP和剪接因子剪接反應兩次轉酯反應剪接體的組裝snRNP:核內小核糖核蛋白拼接體：主要由mRNA前體、mRNA前體結合蛋白和5種snRNP在細胞內，安裝一定的次序組裝成的超分子復合物BBP:分支點結合蛋白順式作用元件：指同一DNA分子中具有轉錄調節功能的特異DNA序列。包括啟動子、增強子等。反式作用因子：指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上參與調控

36、靶基因轉錄效率的蛋白質。多為轉錄因子。內含子的歸巢：Intron（基因內區）中有ORF，可編碼內切酶，使intron 以原來的DNA形式或作為RNA的DNA 拷貝插入一條新的靶位點。gRNA：指導RNA前體的后加工核糖核酸酶P：原核生物中，切除轉移核糖核酸(tRNA)前體的5端序列產生成熟tRNA 5端的核糖核酸內切酶。該酶含有蛋白質和RNA兩組分，其蛋白質組分沒有催化活性，而RNA組分具有全酶的催化活性，是一種核酶。第九章 蛋白質的生物合成擺動規則：密碼子在與反密碼子之間進行堿基配對的時候，前兩個堿基嚴格遵守標準的堿基配對規則，第三個堿基則具有一定的自由度。擺動規則的意義在于使得在翻譯的過程

37、中，tRNA和mRNA有一對堿基不是嚴格配對，氫鍵較弱更容易分離，從而加快翻譯的速度。損傷mRNA的搶救合成：無終子密碼子的缺陷的mRNA結合的核糖體當翻譯到斷裂的末端，將裹足不前，難以解離。E. coli和其它細菌已發展了一套專門的機制處理這些無終止密碼子的有缺陷的mRNA，這種機制為反式翻譯。反式翻譯不同于一般的順式翻譯，它將兩個mRNA翻譯成一條融合的肽鏈，其中有一個mRNA分子無終止密碼子，另一個mRNA分子是tmRNA翻譯的抑制劑林可霉素、氯霉素、紅霉素、鏈霉素和四環素林可霉素：抑制原核生物的轉肽活性氯霉素：抑制原核生物的轉肽活性，結合在L16附近，似乎阻止氨酰-tRNA的酰胺基端與

38、A部位的正確結合。紅霉素：阻止多肽鏈離開通道的入口。鏈霉素：干擾密碼子與反密碼子的配對，導致mRNA的誤讀，也能抑制起始反應。四環素：抑制酰胺-tRNA與A部的結合。第十章 多肽鏈折疊與翻譯后加工蛋白質折疊的三條途徑：（）不依賴于分子伴侶的折疊；（）受熱激蛋白幫助的折疊；（）受熱激蛋白和伴侶蛋白復合物幫助的折疊幾種有促進蛋白折疊功能的大分子:1. 分子伴侶2. 蛋白二硫鍵異構酶 3. 肽-脯氨酰順反異構酶 分子伴侶：細胞中一類保守蛋白質，可識別肽鏈的非天然構象，促進各功能域和整體蛋白質的正確折疊。 （1）熱休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和Gr

39、eE族 （2）伴侶素(chaperonins) GroEL和GroES家族熱休克蛋白促進蛋白質折疊的基本作用：結合保護待折疊多肽片段，再釋放該片段進行折疊。形成HSP70和多肽片段依次結合、解離的循環。 伴侶素的主要作用:為非自發性折疊蛋白質提供能折疊形成天然空間構象的微環境。10.2 蛋白質翻譯后的定向與分揀 定向與分揀：蛋白質合成后所經歷的轉移和定位的過程稱為蛋白質的定向與分揀。細胞內蛋白質定向、分揀的途徑分為：共翻譯途徑在翻譯延伸還沒有結束的時候就被啟動；翻譯后途徑需要在翻譯結束以后才被啟動。10.2.1 共翻譯途經信號肽：是一段在一級結構上連的續氨基酸序列，是蛋白質分揀信號。能夠引導蛋

40、白質從細胞液進入內質網、高爾基體、胞外、細胞核、線粒體葉綠體和過氧化物酶體。信號斑：是存在于已折疊的蛋白質表面的三維分揀信號。信號識別顆粒：Signal Recognition Particle（）第11章 原核生物基因表達調控基因表達調控水平：水平、轉錄水平、轉錄后加工水平、翻譯水平、翻譯后加工水平基因表達的調控方式：負調控:調控蛋白（阻遏蛋白）+DNA序列阻遏基因的表達(相應蛋白質降低) 正調控:調控蛋白（激活蛋白）+DNA序列促進基因的表達(相應蛋白質增加)相關效應物：誘導物或輔阻遏物負調控：無調節蛋白存在時 操縱子中的結構基因是表達的；加入調節蛋白與DNA序列相互作用之后，基因的表達就

41、被關閉了，這樣的調控就叫做負調控。負調控系統中的調節蛋白叫做阻遏蛋白。在負調控中，反式作用的阻遏物與順式作用的操縱子區域結合，關閉操縱子，終止基因的轉錄。許多阻遏物都能以活性和無活性的狀態存在。 誘導物的結合能使阻遏物失活，輔阻遏物的結合則能激活無活性的阻遏物，使之變為活性狀態。正調控：無調節蛋白存在時基因是關閉的，加入調節蛋白后調節蛋白與DNA的結合能促進結構基因的表達，這樣的調節方式叫做正調控。正調節中的調節蛋白叫做激活蛋白或正調節蛋白。操縱子處于關閉狀態是指它的表達水平很低，但總還是存在本底水平的基因表達。在正調控中，反式作用因子須與順式作用位點結合以利于基因的轉錄。在正調控中，反式作用

42、因子須與順式作用位點結合以利于基因的轉錄。順式作用元件：是指對基因表達有調節活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處在一個DNA分子上的基因；同時，DNA序列通常不編碼蛋白質，多位于基因旁側或內含子中，如啟動子、操縱子、終止子。順式作用元件的作用屬于順式作用。反式作用因子是能調節與它們接觸的基因的表達的各種擴散分子（RNA或蛋白質），如轉錄因子；其編碼基因與其識別或結合的靶核苷酸序列不在同一個DNA分子上。基因的產物（RNA或蛋白質）的作用屬反式作用。基因的產物（RNA或蛋白質）的作用屬反式作用調控基因則屬于反式作用元件其編碼產生的調控蛋白為反式作用因子。操縱子：是原核生物基因表達和調控的基

43、本單位，包括結構基因和調控元件（調節基因、操作子（操縱基因，operator）和啟動子、終止子）兩部分。結構基因：操縱子中被調控的編碼蛋白質的基因。調節基因：編碼與操縱子結合的調控蛋白的基因。操作子(操縱基因)：凡能與調控蛋白特異性結合、從而影響基因轉錄強弱的序列，不論其對基因轉錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操作子。效應物：某些特定的物質能與調控蛋白結合，使調控蛋白的空間構像發生變化，從而改變其對基因轉錄的影響，這些特定物質可稱為效應物。誘導物：其中凡能引起誘導發生的分子稱為誘導物（inducer），它與調控蛋白的結合能促進基因的表達。誘導物能與處于活性狀態的阻遏蛋白結合，使之失活

44、而不能與操作子結合，于是RNA聚合酶就能起始轉錄。輔阻遏物：能導致阻遏發生的分子稱為輔阻遏物（corepressor），它與調控蛋白的結合能阻遏基因的表達式。輔阻遏物與阻遏物結合,使之變為活性形式(激活)后與操作子結合,抑制操縱子.操縱子類型：誘導性操縱子（如乳糖操縱子）、阻遏型操縱子（如色氨酸操縱子）別乳糖：乳糖的一種代謝產物。一種乳糖異構體，為乳糖操縱子的天然誘導物。操作子：凡能與調控蛋白特異性結合、從而影響基因轉錄強弱的序列，不論其對基因轉錄的作用是減弱、阻止或增強、開放，都可稱為操作子。葡萄糖效應:指當葡萄糖和其它糖類一起作為細菌的碳源時葡萄糖總是優先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖類

45、的利用的現象。乳糖操縱子的結構由阻遏蛋白基因（I）、啟動子（P）、操縱基因（O）和編碼與乳糖利用密切相關的三個酶的結構基因：Z（半乳糖苷酶）、Y （乳糖透過酶）、A （轉乙酰酶）區段組成。阻遏蛋白基因（I）屬于組成型的調控，是經常表達的，因此，lac操縱子通常是處于關閉狀態的。lac操縱子的調控1、由調節基因表達的乳糖阻遏蛋白的可誘導的負調控2、由CAP-cAMP引起的正調控lac基因可誘導的負調控：1，lac阻遏蛋白與操作子結合，在沒有乳糖存在時，lac操縱子處于阻遏狀態。I基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成型表達產生阻遏蛋白R，每個細胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。R以四聚體形

46、式與操縱子結合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結合，阻止了基因的轉錄起動。2 阻遏蛋白與操作子的解離，當有乳糖存在時，細胞中很低水平的乳糖透過酶能使乳糖透過細胞膜被細胞攝取。乳糖受半乳糖苷酶的催化轉變為別乳糖，別乳糖是天然的誘導物，與阻遏蛋白結合使之變構，由四聚體解聚成單體，導致其與操作子的親和力下降1000倍，結構基因開放，RNA聚合酶結合，轉錄開始。乳糖對lac操縱子的誘導作用：一些化學合成的乳糖類似物，不受半乳糖苷酶的催化分解，卻也能與R特異性結合使R構象變化，誘導lac操縱子的開放。異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog- alactoside，IPTG)：誘導劑，不被

47、細菌代謝而十分穩定，與阻遏蛋白特異性結合，并誘導阻遏蛋白構象發生改變，導致lac操縱子的開放。X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：人工合成的半乳糖苷，可被半乳糖苷酶水解產生藍色化合物沉淀，因此可以用作半乳糖苷酶活性的指示劑。IPTG作為誘導物與LacI的基因產物阻遏蛋白結合，使之轉變為無活性形式而不能與操作子結合，于是RNA聚合酶就能起始基因的轉錄（LacZ基因），表達。LacZ基因表達產物半乳糖苷酶則將底物X-gal水解，產生藍色化合物。假如多克隆位點中插入了外源基因，則LacZ不能表達，于是X-gal也不被水解，底物就仍為白色。重組菌落就是白色，非重組菌就是藍色。所謂藍白斑篩選。色氨酸操縱子的結構：啟動子（trpP）、一個操