1、實驗九、十微生物的生理生化反應一、目的要求 1.了解細菌的一般生化反應； 2.了解細菌的生化鑒定方法其原理。 二、實驗材料 菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；自己分離的大腸桿菌。 培養基：糖發酵培養基（葡萄糖）(紫色液體內帶指管）； H2S試驗用培養基（黃色固體）； 蛋白胨水培養基（黃色液體，吲哚試驗用）； 淀粉培養基（黃色固體需融化倒平板）； 葡萄糖蛋白胨水培養基（黃色液體，甲基紅，VP試驗用）*。試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；VP試劑。三、實驗原理及方法 由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質利用后所產生的代謝產物也不同，我們可以用化學反應來測定微生物的代謝產物，這種反應

2、稱為生化反應。 生化反應常用來鑒別在形態或其它方面不易區別的微生物，例如：腸道細菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態上不易區分，但前者能發酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發酵乳糖來區別它們，所以微生物的生化反應是微生物分類鑒定的重要依據之一。 1.糖發酵試驗： 糖發酵試驗是常用的生化反應，在腸道細菌的鑒定上尤為重要，絕大多數細菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細菌的分解糖類的能力上有相當大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，并產酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、氫、二氧化碳），或者只產酸而不產生氣體。酸和氣體的產生與否，可以由培養后試管指示劑的顏色變化和小套管內氣泡的有無來判定。當發

3、酵產酸時，指示劑溴甲酚紫由紫色（pH6.8）變為黃色（pH5.2）。其步驟如下： （1）取盛有葡萄糖發酵培養基的試管四支（內裝有小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置37培養24小時觀察。大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、對照。 （2）觀察結果：經培養后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時觀察小套管中有無氣泡產生。“+ +”表示產酸；“”表示產酸產氣；“- -”表示陰性。 2 2吲哚試驗 某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結合，形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應變化如下：

4、（1 1）取蛋白胨水培養基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別，置3737培養2424小時。 （2 2）培養后取出，在培養液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養基的上面，這時再沿管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出現。有紅色環出現者為陽性，黃色者為陰性。 （注意：加入試劑后不可再搖動，否則被混合，紅色不明顯。） 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。3 3產硫化氫試驗 某些菌能分解含硫的有機物或無機物產生硫化氫（H H2 2S S），H H

5、2 2S S遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定H H2 2S S的產生與否。 其測定方法有兩種： 一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養基穿刺培養，看是否有黑色沉淀（本實驗采用）； 另一種是在盛有液體培養基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經培養后看醋酸鉛試紙是否變黑。其步驟如下： （1 1）取H H2 2S S試驗用培養基四支（內含有檸檬酸鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空白，試管上注明菌名和組別，置3737培養2424小時。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。（2 2）培養后取出觀察，看有

6、無黑色沉淀產生。4 4伏一普（Voges-proskauerVoges-proskauer）試驗， 即V VP P反應某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉化成乙酰甲基甲醇，如加入強堿液，即與空氣中的氧起作用產生二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用生成紅色化合物，稱陽性反應，沒有紅色化合物產生則稱陰性反應。實驗步驟：（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養基四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別。置3737培養2424小時。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養后取出，

7、加入5-105-10滴40%KOH40%KOH及等量的V VP P試劑液，用 力振蕩，放置3737溫室15-3015-30分鐘，呈紅色者為陽性，不呈 紅色者為陰性。 5 5甲基紅試驗（M MR R試驗） 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能產生大量的酸，使pHpH降低至4 45 5，它先產生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示（有效pHpH范圍為4.24.26.36.3）。 細菌分解葡萄糖產酸，則培養液由原來的桔黃色，變為紅色，即為甲基紅反應。 實驗步驟： （1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養基四支，一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接

8、枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置37培養24小時。大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。（2 2）培養后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑3 34 4滴上層呈紅色者為陽性。 6 6淀粉水解試驗 某些細菌可以產生能水解培養基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。 實驗步驟： （1 1）淀粉培養基在水浴中融化后，冷至5050，以無菌操作制成平板。用接種環取少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+ +”字形接種（或點種），另取少量大腸桿菌菌在平板的另一邊接種，在各培養皿底部標明菌名和組別。置3737溫箱中培養1

9、6162020小時。大腸桿菌，枯草桿菌。 （2 2）觀察結果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養基上，輕輕旋轉培養皿，使碘液均勻鋪滿整個平板。如果在菌周圍出現無色透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。 五、結果與思考題1 1將實驗結果填于書P120P120表中試驗結果：“+ +”表示陽性反應；“- -”表示陰性反應。 2 2細菌的生化反應試驗意義何在？ 、糖發酵試驗：糖發酵培養基， 大腸桿菌、自己分離的大腸桿菌、枯草桿菌、空白對照。 2、H2S試驗：半固體培養基， 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，變形桿菌，空白對照。3 3、吲哚試驗：蛋白胨水培養基； 大腸桿菌，自己分離的大腸桿

10、菌，枯草桿菌，空白對照。4 4、淀粉水解試驗：淀粉培養基到平板； 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。5、V VP P反應：葡萄糖蛋白胨水培養基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。6 6、甲基紅試驗（M MR R試驗）：葡萄糖蛋白胨水培養基*。 大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，空白對照。.糖發酵試驗：經培養后，指示劑呈黃色者表示為陽性，同時觀察小套管中 有無氣泡產生。“+ +”表示產酸；“”表示產酸產氣；“- -”表示陰性。 2.H2S試驗：培養后取出觀察，看有無黑色沉淀產生. .有“+ +”3.3.吲哚試驗：在培養液中先加入乙醚約1 1毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振 蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養基的上面，這時再沿 管壁慢慢加入吲哚試劑5 51010滴，觀察有無紅色出