1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 實驗計劃書（初定） xxxxxxx年xx月xx號此為初步計劃書，還有很多不成熟甚至錯誤之處，望老師給予指出！I 總體計劃本實驗總體上分為三大步。（1）生理實驗部分：本部分主要進(jìn)行papaya硬度和細(xì)胞壁相關(guān)酶類活性的測定。（2）分子實驗部分：本部分主要是獲得papaya細(xì)胞壁相關(guān)酶類的基因序列以及由RNA差異表達(dá)譜獲得細(xì)胞壁代謝酶基因等的表達(dá)特征。（3）驗證實驗部分：本部分主要通過實時熒光定量PCR的方法(Real time Q-PCR)驗證并初步確定與“橡皮化”相關(guān)的細(xì)胞壁代謝酶基因的家族成員。 生理實驗部分是第一步需要實施的，也是比較獨立的部分，初步定為40天左

2、右的時間結(jié)束。分子實驗和驗證實驗部分是本實驗的核心，這兩部分緊密結(jié)合，需要同步進(jìn)行，首先是各種樣本（CK，ETH，1-MCP)的獲得,隨后是各樣本的RNA提取，然后委托深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并從轉(zhuǎn)錄組中篩選細(xì)胞壁代謝相關(guān)的基因序列,采用5RACE及3RACE的方法,獲得這些基因的全長序列以及構(gòu)建差異表達(dá)譜進(jìn)行相關(guān)差異基因篩選等生物信息分析，最后通過實時熒光定量PCR的方法(Real time Q-PCR)驗證并初步確定與“橡皮化”相關(guān)的細(xì)胞壁代謝酶基因的家族成員。II 詳細(xì)計劃一，買果。二，采后預(yù)處理： 采后立即運回實驗室，剔除病果和機(jī)械損傷果，選用形狀、大小、外觀顏色相對一致的番木瓜

3、果實，剪留0.5cm長果柄為實驗材料。先用1.0 g/L的次氯酸鈉溶液洗果10 min，再用0.5g/L的施保功溶液浸泡果實10 min，取出晾干后備用。三，樣品分組（四組）： 1.對照組：果實用PE（聚乙烯）保鮮袋包裝，輕綁袋口，置于低溫（15）的恒溫箱中貯藏。 2.1.0l/L的1-MCP處理（橡皮化果實）：在室溫條件下（25），用濃度1.0l/L的1-MCP密閉熏蒸處理果實24 h，取出果實后用PE保鮮袋包裝，輕綁袋口，置于15（冷藏）、RH（相對濕度）為90%的條件下貯藏。 3.0.5 g/L的乙烯利處理：在室溫條件下（25），用濃度0.5 g/L的乙烯利處理果實3分鐘，取出果實后用P

4、E保鮮袋包裝，輕綁袋口，置于15（冷藏）、RH為90%的條件下貯藏。四，實驗過程：貯藏過程中每隔2d（催熟果實）和5d取樣一次，鮮果或-70貯存，為以后進(jìn)行基因表達(dá)水平的研究。取樣的同時，進(jìn)行以下生理指標(biāo)的測定： 1.果實硬度： 使用果實硬度計（FHM-1型,日本產(chǎn)）進(jìn)行測定。 2.PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性： 稱取1g果肉，加入5mL(先加3 mL,后用2mL沖洗) 0.05mol/L，pH4.6的檸檬酸緩沖液低溫存放（含5%NaCl和1.8 mM的EDTA（乙二胺四乙酸），冰浴研磨勻漿。然后在10000轉(zhuǎn)離心30min，將上清液進(jìn)行透析，用0.05mol/L，pH4.6的檸檬酸緩沖液作為

5、透析液，透析液不含EDTA和NaCl。透析條件：4條件下放24小時，中間換一次緩析液，透析完的溶液用于酶活力的測定。該操作在冰浴下進(jìn)行。 PG活性測定：PG 活性測定以1% 多聚半乳糖醛酸 (PGA , 美國Sigma 公司) 為底物, 反應(yīng)混合液為：1% PGA0.5 mL、醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)1.5 mL、酶提取液0.5 mL, 0.5 mL的水（總反應(yīng)體系為3mL）, 40 反應(yīng)60 min, 立即加入1mLDNS (3, 5-二硝基水楊酸)終止反應(yīng)。再加入沸水中煮沸10 min 后冷卻，于波長540 nm 下定量分析酶水解生成的半乳糖醛酸含量。以3mL蒸餾水+1 mLDNS作為

6、對照（CK）。以每小時釋放1mg 的D-半乳糖醛酸(美國Sigma 公司) 為1 個酶活性單位（U）。以標(biāo)準(zhǔn)D-半乳糖醛酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗重復(fù)3 次。對照不加酶液，以緩沖液代替。 3.PME（果膠甲酯酶）酶活性： 取2g果肉，加3mL 預(yù)冷的1 mol/L NaCl 和2 g PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）置于研缽中，充分研磨后，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用2mL NaCl潤洗，倒入離心管中，于冰浴中放置1小時，每隔20 min震蕩一次，在4下，10000轉(zhuǎn)離心30 min，收集上清液，用0.01 mol/L NaOH調(diào)至pH為7.5, 于4保存?zhèn)溆谩y定：在試管中依次加入1.5mL 0.5% (w/v

7、)的果膠放冰箱備用，有效期5天、0.5 mL0.01%溴麝香酚蘭指示劑棕色瓶(pH為7.5)，1.0 mL水，0.5 mL酶液（酶液最后加入），總反應(yīng)體系為3.5 mL 。立即將試管放入37的水浴鍋中30 min，以蒸餾水為CK。取出試管后冷卻，迅速測定其在620 nm波長一分鐘內(nèi)的變化。以每min變化0.01為一個活力單位（U），以U/ g.FW表示。 4.纖維素酶(CX)： 取0.625g羧甲基纖維素鈉溶于0.2 mol/L（pH為4.6）的醋酸鈉緩沖液中，加幾滴氫氧化鈉調(diào)PH值到7.0，放低溫下溶解，定容至100 mL。 酶液的制備同PG。活性測定：反應(yīng)體系為1 mL CMC（羧甲基纖維

8、素鈉）溶液，酶液1 mL，醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)1.0 mL（總反應(yīng)體系為3mL）,40 保溫60 min，取出加入3，5一二硝基水楊酸（DNS）1 mL終止反應(yīng)；加入沸水中煮沸5 min，冷卻后用分光光度計在540nm處比色測定吸光度值。以3mL蒸餾水+1 mLDNS作為對照（CK）。每小時由底物生產(chǎn)1mol葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。 纖維素酶活力（U/g）=葡萄糖含量（mg）×酶液提取總體積（mL）×5.56/反應(yīng)液中酶液加入量（mL）×樣品重（g）×時間（h）式中5.561 mg葡萄糖的微摩爾數(shù)（1000/180=5.56）

9、；用3, 5-二硝基水楊酸測定生成的葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.內(nèi)切木聚糖酶活性： 酶液的制備同PG。 活性測定：反應(yīng)體系為1 mL5mg/mL的燕麥木聚糖溶液，酶液1 mL，醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)1.0 mL（總反應(yīng)體系為3mL）,40 保溫60 min，取出加入3，5一二硝基水楊酸（DNS）1 mL終止反應(yīng)；加入沸水中煮沸5 min，冷卻后用分光光度計在540nm處比色測定吸光度值。以3mL蒸餾水+1 mLDNS作為對照（CK）。 在特定條件下, 每分鐘水解木聚糖形成1mol木糖(還原糖)所需酶量為1個酶活力單位(U )。 6.內(nèi)切葡聚糖酶活性： 酶液的制備同PG。 活性測定：反應(yīng)體系為

10、1 mL1%昆布多糖，酶液1 mL，醋酸鈉緩沖液(pH 4.6)1.0 mL（總反應(yīng)體系為3mL）,40 保溫60 min，取出加入3，5一二硝基水楊酸（DNS）1 mL終止反應(yīng)；加入沸水中煮沸10 min，冷卻后用分光光度計在540nm處比色測定吸光度值。以3mL蒸餾水+1 mLDNS作為對照（CK）。 1min 生成1g還原糖定義為1個酶活力單位。 7.b-半乳糖苷酶活性： 酶液的制備同PG。 活性測定：反應(yīng)體系為1 mL20mmol/L鄰硝基苯B-D-吡喃半乳糖( ONPG) 底物溶液，酶液1 mL，檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.6)1.0 mL（總反應(yīng)體系為3mL）,40保溫60 min，

11、取出加入0.5mol/L 碳酸鈉冷1 mL終止反應(yīng)；后用分光光度計在420nm處比色測定吸光度值。以3mL蒸餾水+1 mL0.5mol/L 冷碳酸鈉作為對照（CK）。 酶活力單位U 定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下(pH 值為4.6,40)每分鐘催化生成1mol產(chǎn)物鄰硝基苯酚( ONP) 所需的酶量為1個單位。五，關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控研究： 1，RNA的提取、轉(zhuǎn)錄組測序用Trizol法分別提取各處理樣品的總RNA，將各樣品的總RNA混合后，采用Oligo(dT)富集mRNA，參照打斷-反轉(zhuǎn)錄-高通量測序的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息分析，拼接組裝得到大量的EST序列，委托深圳華大基因研究院進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。從

12、轉(zhuǎn)錄組中篩選細(xì)胞壁代謝相關(guān)的基因序列,采用5RACE及3RACE的方法,獲得這些基因的全長序列。 Trizol法、準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75乙醇，無RNase的水或0.5SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。、操作步驟：. 勻漿處理：a. 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10。b. 單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提

13、取的RNA有DNA污染。c. 細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。. 將勻漿樣品在室溫（15-30）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-810000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。.

14、 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。. 2-810000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60。. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。. 2-810000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。. 用75乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。. 室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l無RNase的水或0.5SDS，用槍頭吸打幾次，55-60放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去離子甲酰胺溶解，-70保存。 2，構(gòu)建 “橡皮化”程度不同的RNA差異表達(dá)譜，篩選與果實“橡皮化”相關(guān)的基因家族成員 提取各處理的RNA