1、第六章第六章 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（protoplast）：植物細(xì)胞中，除細(xì)）：植物細(xì)胞中，除細(xì)胞壁以外的成分胞壁以外的成分原生質(zhì)體研究的意義原生質(zhì)體研究的意義：1、研究植物細(xì)胞壁的形成、研究植物細(xì)胞壁的形成2、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合和細(xì)胞雜交、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合和細(xì)胞雜交3、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)外源基因、實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)外源基因、DNA片段、細(xì)胞器、片段、細(xì)胞器、染色體的捕獲染色體的捕獲原生質(zhì)體為植物遺傳工程研究提供了一個(gè)方便原生質(zhì)體為植物遺傳工程研究提供了一個(gè)方便的遺傳操作實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的遺傳操作實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)第一節(jié)第一節(jié) 原生質(zhì)體研究概況原生質(zhì)體研究概況分離原生質(zhì)體的方法分離原生質(zhì)體的方法1、機(jī)械法、機(jī)械法葉

2、肉或其它細(xì)胞放在高滲的蔗糖溶液中，使細(xì)胞葉肉或其它細(xì)胞放在高滲的蔗糖溶液中，使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形，完全脫發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形，完全脫離細(xì)胞壁。剪碎組織，可釋放原生質(zhì)體。離細(xì)胞壁。剪碎組織，可釋放原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，無(wú)法從分生組織分離原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：產(chǎn)量低，無(wú)法從分生組織分離原生質(zhì)體。2、酶法（在第二節(jié)詳述）、酶法（在第二節(jié)詳述）1960，Cocking最先采用最先采用原生質(zhì)體培養(yǎng)的成果原生質(zhì)體培養(yǎng)的成果1971，Nagata和和Takebe從培養(yǎng)的煙草葉肉細(xì)從培養(yǎng)的煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體獲得完整的再生植株胞原生質(zhì)體獲得完整的再生植株我國(guó)學(xué)者在我國(guó)學(xué)者在50多種植

3、物上首先獲得原生質(zhì)體多種植物上首先獲得原生質(zhì)體再生植株，并得到多種植物的細(xì)胞雜種再生植株，并得到多種植物的細(xì)胞雜種中科院植物所、遺傳所、上海植物生理研究中科院植物所、遺傳所、上海植物生理研究所做出了重要貢獻(xiàn)。所做出了重要貢獻(xiàn)。第二節(jié)第二節(jié) 原生質(zhì)體分離原生質(zhì)體分離1、材料選擇及預(yù)處理、材料選擇及預(yù)處理雙子葉植物的幼葉、子葉、根和下胚軸的雙子葉植物的幼葉、子葉、根和下胚軸的切段切段通常被用來(lái)制備原生質(zhì)體通常被用來(lái)制備原生質(zhì)體禾谷類植物，疏松易碎的愈傷或懸浮培養(yǎng)禾谷類植物，疏松易碎的愈傷或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞是制備原生質(zhì)體的理想材料是制備原生質(zhì)體的理想材料預(yù)處理目的：改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀預(yù)處理

4、目的：改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，增加細(xì)胞膜的強(qiáng)度，提高酶解效率，態(tài)，增加細(xì)胞膜的強(qiáng)度，提高酶解效率，減少原生質(zhì)體損傷。減少原生質(zhì)體損傷。預(yù)處理方法預(yù)處理方法1、枝條暗處理、枝條暗處理 獲得的原生質(zhì)體有活力，并能繼續(xù)分裂。獲得的原生質(zhì)體有活力，并能繼續(xù)分裂。2、葉片萎蔫處理、葉片萎蔫處理 有利于撕除下表皮和原生質(zhì)體分離有利于撕除下表皮和原生質(zhì)體分離3、葉片預(yù)培養(yǎng)、葉片預(yù)培養(yǎng) 葉片撕掉下表皮，在誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)葉片撕掉下表皮，在誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，再酶解脫壁，原生質(zhì)體分裂頻率提高很多。一段時(shí)間，再酶解脫壁，原生質(zhì)體分裂頻率提高很多。4、預(yù)先質(zhì)壁分離處理、預(yù)先質(zhì)壁分離處理 先

5、在糖溶液中質(zhì)壁分離，再酶解去壁，可加快原先在糖溶液中質(zhì)壁分離，再酶解去壁，可加快原生質(zhì)體釋放，提高其活力。生質(zhì)體釋放，提高其活力。5、胚性愈傷和懸浮細(xì)胞系的預(yù)培養(yǎng)、胚性愈傷和懸浮細(xì)胞系的預(yù)培養(yǎng) 新鮮培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間再分離原生質(zhì)體，新鮮培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間再分離原生質(zhì)體，質(zhì)量好，分裂頻率高。質(zhì)量好，分裂頻率高。制備原生質(zhì)體的酶類制備原生質(zhì)體的酶類纖維素酶：自綠色木霉提取纖維素酶：自綠色木霉提取果膠酶：自根霉提取，將植物組織解析為單個(gè)細(xì)胞果膠酶：自根霉提取，將植物組織解析為單個(gè)細(xì)胞崩潰酶：同時(shí)具有纖維素酶和果膠酶活性，用于從崩潰酶：同時(shí)具有纖維素酶和果膠酶活性，用于從根尖細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞分離

6、原生質(zhì)體根尖細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞分離原生質(zhì)體半纖維素酶半纖維素酶蝸牛酶：對(duì)孢粉素和木質(zhì)素均有一定分解能力，可蝸牛酶：對(duì)孢粉素和木質(zhì)素均有一定分解能力，可從花粉母細(xì)胞、四分體、小孢子或較老的植物組從花粉母細(xì)胞、四分體、小孢子或較老的植物組織分離原生質(zhì)體織分離原生質(zhì)體酶溶液的配制酶溶液的配制 為保持釋放出的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，要為保持釋放出的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，要求酶液滿足以下條件：求酶液滿足以下條件：1、酶液滲透壓必須與處理細(xì)胞的滲透壓相似酶液滲透壓必須與處理細(xì)胞的滲透壓相似同一種植物，子葉和下胚軸游離原生質(zhì)體時(shí)需要的滲透同一種植物，子葉和下胚軸游離原生質(zhì)體時(shí)需要的滲透壓最高，愈傷次之，胚

7、性懸浮細(xì)胞要求最低。壓最高，愈傷次之，胚性懸浮細(xì)胞要求最低。可用原生質(zhì)體培養(yǎng)基做溶劑，其滲透壓合適。可用原生質(zhì)體培養(yǎng)基做溶劑，其滲透壓合適。2、酶液添加酶液添加CaCl2 2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸鉀和葡聚糖硫酸鉀以提以提高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。還可加入高原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性。還可加入AgNO3減少酶解產(chǎn)減少酶解產(chǎn)生的乙烯生的乙烯，加入過(guò)氧化物歧化酶減輕加入過(guò)氧化物歧化酶減輕O2自由基對(duì)細(xì)胞自由基對(duì)細(xì)胞膜損傷膜損傷，從而提高原生質(zhì)體植板率。，從而提高原生質(zhì)體植板率。3、MES（嗎啉乙基磺酸）作為（嗎啉乙基磺酸）作為pH緩沖調(diào)節(jié)劑對(duì)于保持緩沖調(diào)節(jié)劑對(duì)于保持酶解物的酸堿環(huán)境起緩沖作用酶解物的

8、酸堿環(huán)境起緩沖作用，增加原生質(zhì)體的釋放，增加原生質(zhì)體的釋放量和穩(wěn)定性。量和穩(wěn)定性。4、酶溶液最適酶溶液最適pH范圍為范圍為5.45.8 酶液配好后，過(guò)濾滅菌備用。酶液配好后，過(guò)濾滅菌備用。 原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體制備材料和酶液體積比：材料和酶液體積比：1：10酶解時(shí)間因材料而異酶解時(shí)間因材料而異酶解溫度酶解溫度2530黑暗或弱光下酶解黑暗或弱光下酶解靜置或搖床上酶解靜置或搖床上酶解原生質(zhì)體活力檢測(cè)方法原生質(zhì)體活力檢測(cè)方法1、形態(tài)：來(lái)自葉肉細(xì)胞的活原生質(zhì)體應(yīng)該綠色，葉綠體、形態(tài)：來(lái)自葉肉細(xì)胞的活原生質(zhì)體應(yīng)該綠色，葉綠體及細(xì)胞內(nèi)小顆粒在不停運(yùn)動(dòng)；來(lái)自愈傷或懸浮細(xì)胞的及細(xì)胞內(nèi)小顆粒在不停運(yùn)動(dòng)；來(lái)自愈傷

9、或懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體，可根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流速度或顆粒狀原生質(zhì)體，可根據(jù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)原生質(zhì)環(huán)流速度或顆粒狀內(nèi)含物布朗運(yùn)動(dòng)快慢來(lái)判斷。內(nèi)含物布朗運(yùn)動(dòng)快慢來(lái)判斷。2、染色：、染色：1酚番紅或伊文斯蘭染色檢測(cè)，活的原生質(zhì)酚番紅或伊文斯蘭染色檢測(cè)，活的原生質(zhì)體不著色，死的立即染色。體不著色，死的立即染色。3、FDA（Fluorescein diacetate，熒光素雙醋酸鹽），熒光素雙醋酸鹽） 活體活體染色染色：FDA能透過(guò)原生質(zhì)體膜，在內(nèi)酯酶作用下水解能透過(guò)原生質(zhì)體膜，在內(nèi)酯酶作用下水解為不能排出的，累積在質(zhì)膜內(nèi)的熒光素。在熒光顯微為不能排出的，累積在質(zhì)膜內(nèi)的熒光素。在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，凡發(fā)淡綠熒光

10、的都是活的原生質(zhì)體。鏡下觀察時(shí)，凡發(fā)淡綠熒光的都是活的原生質(zhì)體。4、CFW（熒光增白劑）染色法：新細(xì)胞壁再生產(chǎn)生綠（熒光增白劑）染色法：新細(xì)胞壁再生產(chǎn)生綠色熒光色熒光第三節(jié)第三節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)1、供體材料：?jiǎn)坞p子葉植物有所不同、供體材料：?jiǎn)坞p子葉植物有所不同2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽：無(wú)機(jī)鹽：大幅度降低銨離子濃度，可以只用硝態(tài)氮，同時(shí)附加有大幅度降低銨離子濃度，可以只用硝態(tài)氮，同時(shí)附加有機(jī)氮源。機(jī)氮源。鈣離子濃度可適當(dāng)增加，提高原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性。鈣離子濃度可適當(dāng)增加，提高原生質(zhì)體膜穩(wěn)定性。碳源和滲透壓：碳源和滲透壓：葡萄糖最適合葡萄糖最適合，應(yīng)過(guò)濾消毒。原生質(zhì)體培養(yǎng)，必須，應(yīng)過(guò)濾消

11、毒。原生質(zhì)體培養(yǎng)，必須提供一個(gè)等滲或稍低于細(xì)胞內(nèi)滲透壓的外界環(huán)境。提供一個(gè)等滲或稍低于細(xì)胞內(nèi)滲透壓的外界環(huán)境。有機(jī)附加物和激素：有機(jī)附加物和激素：VBVB1 1、VBVB6 6、煙酸是必需的、煙酸是必需的。很多時(shí)候，只需要很多時(shí)候，只需要生長(zhǎng)素，尤其生長(zhǎng)素，尤其2,4-D2,4-D條件培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基培養(yǎng)生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞一段時(shí)間后，除去細(xì)條件培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基培養(yǎng)生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞一段時(shí)間后，除去細(xì)胞的培養(yǎng)液胞的培養(yǎng)液pHpH：5.65.65.85.8，以，以MESMES、葡聚糖硫酸鉀等調(diào)節(jié)、葡聚糖硫酸鉀等調(diào)節(jié)常用基本培養(yǎng)基：常用基本培養(yǎng)基：KM8pKM8p和和NTNTKM8pKM8p：高國(guó)楠建立

12、，用于豆科和禾谷類原生質(zhì)體培養(yǎng)：高國(guó)楠建立，用于豆科和禾谷類原生質(zhì)體培養(yǎng)NTNT：雙子葉植物原生質(zhì)體培養(yǎng)：雙子葉植物原生質(zhì)體培養(yǎng) 培養(yǎng)基通常過(guò)濾消毒培養(yǎng)基通常過(guò)濾消毒 培養(yǎng)的原生質(zhì)體密度培養(yǎng)的原生質(zhì)體密度 培養(yǎng)單個(gè)原生質(zhì)體之前，最好在高密度下培養(yǎng)數(shù)天。培養(yǎng)單個(gè)原生質(zhì)體之前，最好在高密度下培養(yǎng)數(shù)天。原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法培養(yǎng)方式：培養(yǎng)方式： 固體培養(yǎng)：瓊脂或平板培養(yǎng)。可定點(diǎn)觀察一個(gè)原生質(zhì)固體培養(yǎng)：瓊脂或平板培養(yǎng)。可定點(diǎn)觀察一個(gè)原生質(zhì)體的再生、生長(zhǎng)和分裂，但分裂慢，操作繁瑣。體的再生、生長(zhǎng)和分裂，但分裂慢，操作繁瑣。 液體淺層培養(yǎng)：簡(jiǎn)單，對(duì)原生質(zhì)體損傷小，易于添加液體淺層培養(yǎng)：簡(jiǎn)單，

13、對(duì)原生質(zhì)體損傷小，易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，但原生質(zhì)體分布不均，易新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，但原生質(zhì)體分布不均，易粘連，難以定點(diǎn)追蹤。粘連，難以定點(diǎn)追蹤。 微滴培養(yǎng)（微滴培養(yǎng)（droplet culture):droplet culture):可進(jìn)行多組合試驗(yàn)，可進(jìn)行多組合試驗(yàn)，可進(jìn)行融合體及單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)和觀察。但易揮發(fā)，可進(jìn)行融合體及單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)和觀察。但易揮發(fā)，可覆蓋礦物油。可覆蓋礦物油。 滋養(yǎng)培養(yǎng)（滋養(yǎng)培養(yǎng)（nurse culture):nurse culture):利用能分泌生物活性物利用能分泌生物活性物質(zhì)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物作為滋養(yǎng)者，促進(jìn)原生質(zhì)體的質(zhì)的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物作為

14、滋養(yǎng)者，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和生長(zhǎng)。分裂和生長(zhǎng)。第四節(jié)第四節(jié) 原生質(zhì)體再生植株的遺傳性狀及變異原生質(zhì)體再生植株的遺傳性狀及變異一般由莖尖、葉肉、胚性組織細(xì)胞分離一般由莖尖、葉肉、胚性組織細(xì)胞分離的原生質(zhì)體能較好保持原來(lái)的倍性的原生質(zhì)體能較好保持原來(lái)的倍性懸浮培養(yǎng)細(xì)胞特別是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的細(xì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞特別是長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)的細(xì)胞分離的原生質(zhì)體較易出現(xiàn)染色體倍性胞分離的原生質(zhì)體較易出現(xiàn)染色體倍性及數(shù)目的變化及數(shù)目的變化變異可能是材料本身存在的，也可能是變異可能是材料本身存在的，也可能是長(zhǎng)期無(wú)性繁殖發(fā)生的。長(zhǎng)期無(wú)性繁殖發(fā)生的。第五節(jié) 性細(xì)胞原生質(zhì)體培養(yǎng)進(jìn)展精細(xì)胞分離精細(xì)胞分離三細(xì)胞花粉：禾本科與十字花科植

15、物，花粉中含有三細(xì)胞花粉：禾本科與十字花科植物，花粉中含有一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和兩個(gè)游離在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和兩個(gè)游離在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的精細(xì)胞，為三細(xì)胞花粉精細(xì)胞，為三細(xì)胞花粉二細(xì)胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一個(gè)營(yíng)二細(xì)胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)生殖細(xì)胞，為二細(xì)胞花粉。花粉萌發(fā)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)生殖細(xì)胞，為二細(xì)胞花粉。花粉萌發(fā)后，生殖細(xì)胞在花粉管中分裂形成兩個(gè)精子。后，生殖細(xì)胞在花粉管中分裂形成兩個(gè)精子。三細(xì)胞花粉，可以直接從成熟花粉中分離精子；二三細(xì)胞花粉，可以直接從成熟花粉中分離精子；二細(xì)胞花粉，需要先進(jìn)行花粉的離體培養(yǎng)，待精子形細(xì)胞花粉，需要先進(jìn)行花粉的

16、離體培養(yǎng)，待精子形成后，再?gòu)幕ǚ酃苤蟹蛛x精子。成后，再?gòu)幕ǚ酃苤蟹蛛x精子。三細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離三細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離1、滲透壓沖擊法：花粉置于低滲溶液中，吸水破裂，釋、滲透壓沖擊法：花粉置于低滲溶液中，吸水破裂，釋放出精細(xì)胞。經(jīng)低速離心，得到精細(xì)胞。放出精細(xì)胞。經(jīng)低速離心，得到精細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：花粉壁碎片大，易于過(guò)濾清除。優(yōu)點(diǎn)：花粉壁碎片大，易于過(guò)濾清除。 缺點(diǎn)：滲透壓突然變化對(duì)精子生理狀態(tài)不利。缺點(diǎn)：滲透壓突然變化對(duì)精子生理狀態(tài)不利。2、研磨法：成熟花粉懸浮于適當(dāng)溶液中，研磨使花粉破、研磨法：成熟花粉懸浮于適當(dāng)溶液中，研磨使花粉破裂，釋放精細(xì)胞。裂，釋放精細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：不過(guò)分依賴花粉成熟度，特

17、別適合于在低滲溶液優(yōu)點(diǎn)：不過(guò)分依賴花粉成熟度，特別適合于在低滲溶液中不易破碎的花粉。中不易破碎的花粉。缺點(diǎn)：花粉壁碎片小，不易清除。缺點(diǎn)：花粉壁碎片小，不易清除。二細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離二細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離1、花粉離體培養(yǎng)法：花粉在液體培養(yǎng)基中人工、花粉離體培養(yǎng)法：花粉在液體培養(yǎng)基中人工萌發(fā)，待形成精細(xì)胞后，用滲透壓沖擊或研磨萌發(fā)，待形成精細(xì)胞后，用滲透壓沖擊或研磨使花粉管破裂。使花粉管破裂。缺點(diǎn)：精細(xì)胞形成不同步，分離的精細(xì)胞中混雜缺點(diǎn)：精細(xì)胞形成不同步，分離的精細(xì)胞中混雜尚未分裂的生殖細(xì)胞，使精細(xì)胞純度降低。尚未分裂的生殖細(xì)胞，使精細(xì)胞純度降低。2、活體離體法：先將花粉授在柱頭上，花粉、活

18、體離體法：先將花粉授在柱頭上，花粉萌發(fā)并產(chǎn)生精子后，用滲透壓沖擊法分離。萌發(fā)并產(chǎn)生精子后，用滲透壓沖擊法分離。優(yōu)點(diǎn)：分離的精細(xì)胞純度高，接近受精前的發(fā)育優(yōu)點(diǎn)：分離的精細(xì)胞純度高，接近受精前的發(fā)育狀態(tài)。狀態(tài)。3、改進(jìn)的活體離體法、改進(jìn)的活體離體法卵細(xì)胞的分離卵細(xì)胞的分離可先分離胚囊，從中分離卵細(xì)胞可先分離胚囊，從中分離卵細(xì)胞也可直接從胚珠中分離卵細(xì)胞也可直接從胚珠中分離卵細(xì)胞周嫦和楊弘遠(yuǎn)首先建立胚囊分離技術(shù)周嫦和楊弘遠(yuǎn)首先建立胚囊分離技術(shù)酶解振蕩法。酶解振蕩法。生活胚囊的分離方法：胚珠放在酶液中，生活胚囊的分離方法：胚珠放在酶液中，酶液：纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、酶液：纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、蝸牛酶或崩潰酶。蝸牛酶或崩潰