1、GB/T xxxx xxxxxxxx食品安全國家標準紅曲類產品中桔青霉素的測定 （征求意見稿）xxxx-xx-xx實施xxxx-xx-xx發布中華人民共和國衛生部 發布中華人民共和國衛生部 發布1.1.1.1 2010-06-01實施2010-××-××發布 前 言本標準代替GB 5009.222-2008。本標準與GB 5009.222-2008相比，主要變化如下： 修改了標準的中文名稱，標準中文名稱改為食品安全國家標準 紅區類產品中桔青霉素的測定（理化方法）；按照GB/T20001.4-2001對原標準的結構進行了修改。食品安全國家標準紅曲類產品中桔

2、青霉素的測定1 范圍本標準規定了紅曲類產品中桔青霉素的測定方法。本標準適用于紅曲米、紅曲紅（固態、液態）、紅曲發酵液和用紅曲菌生產的保健食品中桔青霉素的測定。2 原理液態紅曲類樣品經乙醇提取、離心、過濾后經高效液相色譜儀（HPLC）分析；固態紅曲類樣品經甲苯-乙酸乙酯-甲酸提取、超聲波萃取、離心、過濾后經HPLC分析，外標法定量。3 試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682中規定的一級水。3.1 試劑3.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。3.1.2 磷酸（H3PO4）：色譜純。3.1.3 甲醇（CH3OH）：色譜純。3.1.4 甲苯（C6H5CH3）。3.

3、1.5 乙酸乙酯（C4H8O2）。3.1.6 甲酸（CH2O2）。3.1.7 無水乙醇（C2H5OH）：色譜純。3.2 試劑配制 復合萃取劑（TEF）：甲苯乙酸乙酯甲酸（7+3+1），配制方法是將7份體積的甲苯（3.5）、3份體積乙酸乙酯（3.1.5）和1份體積酌甲酸（3.1.6）混合而成。3.3 標準品 桔青霉素（C13H14O5）標準品：純度>99%。3.4 標準溶液制備3.4.1 桔青霉素標準貯備溶液（50 mg/L）：準確稱取桔青霉素標準品，用甲醇溶解并定容至濃度為50 mg/L，密封后4 冰箱避光保存。3.4.2 桔青霉素標準工作溶液（5 mg/L）：用甲醇將10mL的50 m

4、g/L桔青霉素標準貯備溶液定容至100 mL，密封后4 冰箱避光保存，工作液現用現配。工作液從冰箱取出后應于室溫下至少放置10 min，渦旋混勻后方可使用。3.4.3 桔青霉素標準曲線工作液：將標準儲備液用甲醇系列稀釋后，配成濃度為0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L的標準曲線工作溶液。4 儀器和設備4.1 高效液相色譜儀，配有熒光檢測器。4.2 超聲波細胞破碎儀。4.3 電子天平（感量0.0001 g）。4.4 pH計（精度0.01）。4.5 勻漿器。4.6 離心機。4.7 旋轉蒸發儀。4.8 微孔有機濾膜（孔徑0.45 µm）。4.9

5、數顯恒溫水浴鍋（溫度精度土1 ）。4.10 渦旋混勻器。4.11 磁力攪拌器。5 分析步驟5.1試樣制備 5.1.1 液態紅曲樣品將帶有菌絲體的液態發酵紅曲樣品勻漿后用吸量管吸取10 mL（液態紅曲紅樣品直接取樣10 mL），置于50 mL具塞試管中，加入20 mL無水乙醇，60 水浴加熱1 h（期間不斷振搖），冷卻至室溫后轉入塑料離心管中，3 000 r/min離心15 min，上清液經0.45 µm濾膜過濾后進行HPLC分析。5.1.2 固態紅曲制品用電子天平（4.3）準確稱取一定量固態紅曲樣品（色素用紅曲米為2 g，用紅曲菌生產的保健食品為3 g，釀酒用曲為3 g）于50 mL

6、具塞比色管中，加入20 mL TEF溶液（3.2），超聲提取10 min（強度40%，工作5 s，間隔5 s），3 000 r/min離心20 min，上清液轉入50 mL具塞試管中，殘渣用15 mL TEF溶液（3.2）同上述步驟再提取兩次，合并三次提取上清液于50 mL具塞比色管中，40真空濃縮（4.7）至干后加入30 mL甲醇溶解，經微孔有機濾膜（4.8）過濾后進行HPLC分析。準確稱取1g粉狀紅曲紅或紅曲黃色素祥品，在磁力攪拌下緩緩加到盛有20 mL TEF溶液（3.2）的燒杯中，繼續攪拌30 min后，3 000 r/min離心20 min，以下按固態紅曲樣品同樣的方法自“上清液轉入

7、50 mL具塞試管中”起，依法操作。5.2 分析步驟5.2.1 液相色譜分析條件 a）色譜柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，粒度5 µm）； b）柱溫：28 ； c）流動相：乙腈（3.2）+水=35+65，水用色譜純磷酸（4.3）調pH至2.5； d）流速：1.0 mL/min； e）檢測器：熒光檢測器，激發波長331 nm，發射波長500 nm； f）進樣量：20 µL。5.2.2 色譜分析分別將20 pL不同質量濃度（0.1 mg/L、0.25 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）的桔青霉素標準溶液（3.10.3）及制備后的樣品溶

8、液（5.1）注入液相色譜儀中，以保留時間定性，以桔青霉素質量濃度與相對應的峰面積繪制工作曲線，獲得線性回歸方程及相關系數，以此計算樣品中的桔青霉素含量。 由于HPLC分析中采用了熒光檢測器，樣品中的雜質對桔青霉素的出峰基本無干擾，因此一般情況下無需確證，必要時用液相色譜質譜進行確證，條件如下： a）毛細管電壓：3.78 kV； b）錐孔電壓：30 V； c）射頻透鏡電壓：0.5 V； d）萃取錐孔電壓：5 V； e）離子源溫度：100 ； f）脫溶劑氣溫度：250 ； g）脫溶劑氣流量：320 L/h； h）電子倍增電壓：650 V； i）相對分子質量范圍：100500。 桔青霉素的液相色譜圖

9、參見附錄A，質譜圖參見附錄B。5.3 標準曲線的制作將標準系列工作液分別注入液相色譜儀中，測定相應的響應值，以標準工作液的濃度為橫坐標，以響應值（如：峰面積、峰高、吸收值等）為縱坐標，繪制標準曲線。5.4 平行試驗將試樣溶液注入液相色譜儀中，得到相應的響應值，根據標準曲線得到待測液中桔青霉素的濃度，平行測定次數不少于兩次。6 分析結果的表述6.1固態樣品中桔青霉素的含量按式（l）計算： 式中： c1樣品中桔青霉素含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；c儀器檢測的質量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V最終定容體積，單位為毫升（mL）；m樣品質量，單位為克（g）。6.2液態樣品中桔青霉素的含量按式（2）計算： 式中：c2樣品中桔青霉素含量，單位為毫克每升（mg/L）；c儀器檢測的質量濃度，單位為毫克每升（mg/L）；V2最終定容體積，單位為毫升（mL）；V1移取的樣