1、魚中結晶紫的檢測方案魚中結晶紫的檢測方案工分專工分專122張啟陽張啟陽、尹彬竹、向乾元、魏俊、尹彬竹、向乾元、魏俊前言前言 結晶紫屬于三苯甲烷類染料，化學性質，暗綠色閃光粉末或粒子。溶于冷水和熱水，呈紫色，極易溶于乙醇。于濃硫酸中呈紅黃色，稀釋后呈暗綠光黃色，然后轉變成藍和紫色，結晶紫這種化合物對魚類的水霉病、寄生蟲病等有很好的療效，長期以來許多國家曾將其作為水產養殖業的殺菌劑。它們在魚體內可分別代謝為和無色結晶紫，由于其母體化合物和代謝物均具有潛在的致癌、致畸、致突變等副作用，20世紀90年代 以來許多國家都將其列為水產養殖的禁用藥物。但 是由于其抗菌效果好、價格便宜，不少業戶仍在違規使用，

2、因此結晶紫殘留監控就顯得格外重要。 實驗材料與方法試驗結果結果討論結晶紫的檢測方案結晶紫的檢測方案123樣品的提取的保存樣品的提取的保存試劑和溶液試劑和溶液 鱸魚，從超市里購買鱸魚活樣品，取其肌肉，各自用均質機鱸魚，從超市里購買鱸魚活樣品，取其肌肉，各自用均質機混均，每個樣品各混均，每個樣品各400 g400 g，于，于-20 -20 冰箱保存備用。冰箱保存備用。 樣品與方法樣品與方法 結晶紫標準品：結晶紫標準品： 純度純度 93.9 %；結晶紫快速檢測前處理試；結晶紫快速檢測前處理試 劑盒，由中國檢驗檢疫劑盒，由中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋商檢新科學研究院北京陸橋商檢新 技術公司生產。酸性

3、氧化鋁固相萃取柱（技術公司生產。酸性氧化鋁固相萃取柱（500 mg， 3 mL），），PRS固相萃取柱（固相萃取柱（500 mg，3 mL），乙腈為），乙腈為 色譜純，無水乙酸銨、冰乙色譜純，無水乙酸銨、冰乙酸、對酸、對-甲苯磺酸、乙酸甲苯磺酸、乙酸 鈉、硼氫化鉀均為分析純，實驗用水為去離子水。鈉、硼氫化鉀均為分析純，實驗用水為去離子水。 孔雀石孔雀石綠乙腈綠乙腈 溶液溶液; 結晶紫標準儲備液：結晶紫標準儲備液：100 g/mL結晶紫乙腈溶液結晶紫乙腈溶液; 、結晶紫混合標準中、結晶紫混合標準中間溶液：間溶液：10 g/mL; 乙酸鈉緩沖液：乙酸鈉緩沖液：0.06 mol/L乙酸鈉乙酸鈉+0.

4、005 mol/L 對甲苯磺酸，對甲苯磺酸，pH4.5; 乙酸銨緩沖溶液：乙酸銨緩沖溶液：0.125 mol/L，pH 4.5; 硼氫化鉀溶液：硼氫化鉀溶液：0.07 mol/L，現配，現配現用現用; 洗脫液：乙酸乙酯洗脫液：乙酸乙酯 甲醇甲醇 氨水體積比氨水體積比10 9 1樣品預處理樣品預處理 提取提?。簻蚀_稱?。簻蚀_稱取 5.00 g已攪碎的樣品于已攪碎的樣品于 50 mL 離心管中，加入結離心管中，加入結晶紫快速檢測前處理晶紫快速檢測前處理 試劑盒中提取劑試劑盒中提取劑 1（20mL，由有機化學試劑，由有機化學試劑組成的組成的 混合液體試劑）和提取劑混合液體試劑）和提取劑 2（由無機化

5、學組成的混（由無機化學組成的混 合粉末試合粉末試劑），劑），8 000 r/min的速度均質的速度均質 30 s，振蕩，振蕩 2 min，4 500 r/min 離離心心 5 min，取上清液，取上清液 10.0 mL 于于 雞心瓶中，雞心瓶中，45 水浴旋轉蒸發至水浴旋轉蒸發至近干，用近干，用 2.5 mL 乙腈溶解殘渣。乙腈溶解殘渣。凈化凈化: 將將 PRS 柱安裝在固相萃取裝置上，上端串聯酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，上端串聯酸性氧化鋁柱，用柱，用 5 mL 乙腈活化，轉移提取液到柱上，再用乙腈活化，轉移提取液到柱上，再用 2.5 mL 乙腈洗滌乙腈洗滌瓶一次，過柱，重復操作一次，去

6、掉酸性氧化鋁柱，用瓶一次，過柱，重復操作一次，去掉酸性氧化鋁柱，用 5 mL 乙腈乙腈清洗清洗PRS柱，氮吹柱，氮吹PRS柱至近干，在不抽真空柱至近干，在不抽真空清況下，加入清況下，加入 5 mL 洗脫液洗脫，收集全部洗脫液，洗脫液洗脫，收集全部洗脫液， 氮氣吹至近干，加氮氣吹至近干，加 0.4 mL 硼氫化硼氫化鉀溶液，還原，靜置鉀溶液，還原，靜置 20 min，用乙腈定溶至，用乙腈定溶至 1.0 mL，經聚四氟乙，經聚四氟乙烯烯膜膜 過濾后上機分析過濾后上機分析 實驗方法的選擇實驗方法的選擇 目前結晶紫檢測方法主要有高效液相色譜法目前結晶紫檢測方法主要有高效液相色譜法1-3和液質聯用法和液

7、質聯用法4-5。我國。我國 于于2006年發布有關的水產行業標準（年發布有關的水產行業標準（SN/T1768- 2006）6及國家標準（及國家標準（GB/T20361-2006）7。行業。行業 標準標準SN/T1768-2006前處理簡單，但是滿足不了檢前處理簡單，但是滿足不了檢 測限測限0.5 g/kg的要的要求。其他方法的前處理均需多次萃取，多次離心，操作煩瑣，前處求。其他方法的前處理均需多次萃取，多次離心，操作煩瑣，前處理時間長，有機理時間長，有機 溶劑用量大，實際檢測工作中存在困難。本文綜溶劑用量大，實際檢測工作中存在困難。本文綜合各個方法標準中快速和靈敏的優點，建立了同時檢測，結晶紫

8、以合各個方法標準中快速和靈敏的優點，建立了同時檢測，結晶紫以及代謝物無色結晶紫總量的及代謝物無色結晶紫總量的高效液相色譜法。 儀器：儀器：Agilent1200 型高效液相色譜儀、均質機、型高效液相色譜儀、均質機、 離心機、離心機、振蕩器、旋轉蒸發器、固相萃取裝置、氮吹儀。振蕩器、旋轉蒸發器、固相萃取裝置、氮吹儀。 色譜條件：色譜柱，色譜條件：色譜柱，Eclipse-C18 250 mm4.6 mm，粒度，粒度 5 m；流動相，乙腈；流動相，乙腈+乙酸銨緩沖液（乙酸銨緩沖液（pH 4.5）=80+20；流速；流速 1.5 mL/min；柱溫；柱溫 35 ；激發；激發 波長波長 265 nm,

9、發射波長發射波長 360 nm；進樣量；進樣量 20 L儀器與色譜條件儀器與色譜條件 在臨用前準確吸取一定量的混合標準中間溶在臨用前準確吸取一定量的混合標準中間溶 液，加入液，加入 0.4 mL 硼氫化鉀溶液硼氫化鉀溶液，用乙腈準確稀釋至，用乙腈準確稀釋至 2.0mL，配制適當濃度的混合標準工作液。在上述，配制適當濃度的混合標準工作液。在上述 色譜色譜條件下，分別測定結晶紫混合標準工作溶液及樣品提取溶液中的結晶紫，條件下，分別測定結晶紫混合標準工作溶液及樣品提取溶液中的結晶紫， 外外標法定量。標法定量。 樣品測定樣品測定 準確度和精密度實驗準確度和精密度實驗 以本底無結晶紫、以本底無結晶紫、

10、隱性結晶紫的鱸隱性結晶紫的鱸魚魚為樣品，平行稱取為樣品，平行稱取3份樣品，份樣品， 按按5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg三個加標濃度進行加三個加標濃度進行加 標，按上述步驟進行前標，按上述步驟進行前處理和色譜測定，分別測定處理和色譜測定，分別測定 各次的峰面積，計算樣品中結晶紫的含量，計各次的峰面積，計算樣品中結晶紫的含量，計算回收率。算回收率。 另取另取 6 個平行樣品，采用添加法分別添加等量結晶紫混合標準個平行樣品，采用添加法分別添加等量結晶紫混合標準溶液，按上述步驟進行溶液，按上述步驟進行 前處理和色譜測定，分別測定各次的峰面積前處理和色譜測定，分別測定各次的峰面積,計算樣計

11、算樣 品中結晶紫的含量，計算相對標準偏差。品中結晶紫的含量，計算相對標準偏差。 計算計算 以標準工作液峰面積和濃度作工作曲線，根據以標準工作液峰面積和濃度作工作曲線，根據 樣品提取液的峰面積，從工作曲樣品提取液的峰面積，從工作曲線計算樣品提取液中結晶紫的殘留量，按式計算樣品中線計算樣品提取液中結晶紫的殘留量，按式計算樣品中 結晶紫殘留量。計算結結晶紫殘留量。計算結果需扣除空白值。果需扣除空白值。 X=(CxVx2)/m 式中：式中：X試樣中的結晶紫的殘留量，試樣中的結晶紫的殘留量，g/kg； C樣品提取液中結晶紫的殘留量，樣品提取液中結晶紫的殘留量，ng/mL； V最終定容體積，最終定容體積，

12、mL； m樣品質量，樣品質量，g。 實驗結果 結晶紫標準色譜圖 本實驗選定色譜條件下、結晶紫的保留時間分別為為 7.9 min、8.5 min 左右，圖 1 為標 準溶液濃度為 30 ng/ mL 的標準色譜圖 以以 HPLC 測得的峰面積測得的峰面積 y為縱坐標，相應的濃為縱坐標，相應的濃 度度 x為橫坐標繪制標準曲線，其線性關系為橫坐標繪制標準曲線，其線性關系和相關系數見表和相關系數見表 1。結果表明，結晶紫在。結果表明，結晶紫在 1.0 ng/mL500 ng/mL 范圍內線性良好，可以范圍內線性良好，可以滿足定量分析的需要。滿足定量分析的需要。 關系數表關系數表 1 線性回歸方程、相、

13、線性范圍線性回歸方程、相、線性范圍 標準曲線 回收率、精密度和靈敏度回收率、精密度和靈敏度 鱸鱸魚魚空白肌肉組織樣品中分別添加空白肌肉組織樣品中分別添加3個濃度個濃度 水平的結晶紫標準溶液，進行回水平的結晶紫標準溶液，進行回收率測定，回收率測定結果見表收率測定，回收率測定結果見表 2，加標樣品圖譜見圖，加標樣品圖譜見圖 2。 由表由表 2 可以看出可以看出，結晶紫加標濃度在結晶紫加標濃度在 5 g/kg20 g/kg 內，回收率為內，回收率為 76.1 92.5 。 六個六個平行樣品測定結果的相對標準偏差（平行樣品測定結果的相對標準偏差（RSD） 分別為：結晶紫，分別為：結晶紫，4.5，重現性

14、，重現性能滿足要求。以信噪比能滿足要求。以信噪比 S/N=3 計算，樣品中結晶紫的檢出限均為計算，樣品中結晶紫的檢出限均為 0.5 g/kg。 討論 凈化條件的選擇凈化條件的選擇 樣品經孔雀石綠快速前處理試劑盒提取后，如果不進一步凈化，直接樣品經孔雀石綠快速前處理試劑盒提取后，如果不進一步凈化，直接上機用熒光檢測器檢測，干擾嚴重。目前文獻資料中多采用氧化鋁柱上機用熒光檢測器檢測，干擾嚴重。目前文獻資料中多采用氧化鋁柱（酸性、（酸性、 中性或堿性）與中性或堿性）與 PRS 小柱串聯來對樣品進行凈化小柱串聯來對樣品進行凈化1,2,5,7。我。我們分別采用正己烷，酸性氧化鋁柱們分別采用正己烷，酸性氧

15、化鋁柱 與與 PRS小柱串聯，對樣品進行了凈小柱串聯，對樣品進行了凈化，實驗中發現，化，實驗中發現， 用正己烷脫脂效果差，干擾嚴重，用酸性氧化鋁和用正己烷脫脂效果差，干擾嚴重，用酸性氧化鋁和 PRS 小柱串聯凈化效果好，所以實驗中采用酸性氧小柱串聯凈化效果好，所以實驗中采用酸性氧 化鋁柱與化鋁柱與 PRS 小柱小柱串聯進行凈化，過串聯進行凈化，過 0.45 m膜后膜后 上機檢測。與文獻相比，本實驗經過一上機檢測。與文獻相比，本實驗經過一次萃取后無次萃取后無 需二氯甲烷反萃取，濃縮后直接用小柱進行凈化，需二氯甲烷反萃取，濃縮后直接用小柱進行凈化， 同樣獲得同樣獲得了較理想的實驗結果。了較理想的實

16、驗結果。 流動相的選擇流動相的選擇 實驗中分別采用（實驗中分別采用（1）乙腈）乙腈+乙酸鈉緩沖液（乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）=80+20；（2）乙腈）乙腈+乙酸銨緩沖液（乙酸銨緩沖液（pH 4.5） =80+20 為流動相進行為流動相進行檢測，實驗結果表明檢測，實驗結果表明用流動相（用流動相（1）進行檢測時基線噪音大，對檢測結果有干）進行檢測時基線噪音大，對檢測結果有干 擾，擾，用流動相（用流動相（2）進行檢測時基線噪音小，對）進行檢測時基線噪音小，對 檢測基本無干檢測基本無干擾。擾。 小結小結 樣品經孔雀石綠快速前處理試劑盒提取，固相萃取柱凈樣品經孔雀石綠快速前處理試劑盒提取，固相萃取柱凈

17、化，硼氫化鉀還原，高效液相色譜化，硼氫化鉀還原，高效液相色譜-熒光檢熒光檢 測法進行檢測，測法進行檢測，成功地進行了水產品中結晶紫殘留量的檢測。試驗結果表成功地進行了水產品中結晶紫殘留量的檢測。試驗結果表明：該方法主要明：該方法主要 綜合了各個方法標準中快速和靈敏這兩個優綜合了各個方法標準中快速和靈敏這兩個優點，并點，并 對前處理過程進行了優化，相對于對前處理過程進行了優化，相對于SN/T1768-2006 及及文獻文獻1，2來說，檢測限從來說，檢測限從2.0 g/kg提高到了提高到了 0.5 g/kg，而相對于而相對于GB/T20361-2006及其它文獻來及其它文獻來 說，前處理大為簡說，

18、前處理大為簡化，大大縮短了檢測時間，減少了有機溶劑用量，靈敏度與化，大大縮短了檢測時間，減少了有機溶劑用量，靈敏度與國標國標7及液質聯用方及液質聯用方 法法5相當（均為相當（均為0.5 g/kg），是水產），是水產品中結晶紫及其代品中結晶紫及其代 謝物隱色結晶紫殘留總量快速而準確的檢謝物隱色結晶紫殘留總量快速而準確的檢測方法。測方法。 參參 考考 文文 獻獻 1 任秀蓮，魏琦峰，曲徑，等任秀蓮，魏琦峰，曲徑，等. 反相高效液相色譜法測定水產品中孔反相高效液相色譜法測定水產品中孔 雀雀石綠、結晶紫及其代謝物石綠、結晶紫及其代謝物J. 中國衛生檢驗雜志中國衛生檢驗雜志, 2006, l6(8):939-940. 2 林洪，付曉婷，邱緒建林洪，付曉婷，邱緒建, 等等. 液相色譜法測定魚肌肉中孔雀石綠、液相色譜法測定魚肌肉中孔雀石綠、 結結晶紫及其代謝物晶紫及其代謝物J.中國海洋大學學報中國海洋大學學報, 2006, 36(6):909-912. 3 朱寬正朱寬正, 王鵬王鵬, 林雁飛，等林雁飛，等. 液相色譜一串聯質譜法同時測定水產液相色譜一串聯質譜法同時測定水產 品品中孔雀石綠、結晶紫以及它們的隱色代謝物殘留中孔