1、 第四節第四節 親和免疫組織化學技術親和免疫組織化學技術n 20世紀世紀70年代以來，隨著免疫組織化學技術的廣泛應用，年代以來，隨著免疫組織化學技術的廣泛應用，一些具有雙價或多價結合力的物質如生物素、植物凝集素和一些具有雙價或多價結合力的物質如生物素、植物凝集素和葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（SPA）等被應用于免疫組織化學技術。這）等被應用于免疫組織化學技術。這些方法的特點是以一種物質對某種組織成分具有高度親和力些方法的特點是以一種物質對某種組織成分具有高度親和力為基礎，為基礎，1976年年Bayer首次稱之為親和組織化學。實際上，首次稱之為親和組織化學。實際上，抗原抗體反應本質上也屬于親和組織

2、化學的范疇。目前，親抗原抗體反應本質上也屬于親和組織化學的范疇。目前，親和組織化學包括抗原與抗體，生物素與抗生物素，植物凝集和組織化學包括抗原與抗體，生物素與抗生物素，植物凝集素和糖類，葡萄球菌蛋白素和糖類，葡萄球菌蛋白A與與IgG，陽離子與陰離子，激素、，陽離子與陰離子，激素、維生素、糖及類脂質作用部位和受體等。維生素、糖及類脂質作用部位和受體等。 一、生物素一、生物素-抗生物素免疫組織化學技術抗生物素免疫組織化學技術 （一）基本原理（一）基本原理 雞蛋中含有一種堿性蛋白，屬于糖蛋白，也稱卵白素雞蛋中含有一種堿性蛋白，屬于糖蛋白，也稱卵白素（avidin），分子量），分子量68000。卵白素

3、具有卵白素具有4個與維生素個與維生素H或稱或稱生物素（生物素（biotin）親和力極高的結合位點）親和力極高的結合位點。生物素是一種小。生物素是一種小分子維生素，分子量分子維生素，分子量244，它與卵白素之間的親和力比抗原，它與卵白素之間的親和力比抗原抗體之間的親和力高抗體之間的親和力高100萬倍，因而能彼此牢固締結和而不萬倍，因而能彼此牢固締結和而不影響各自的生物活性。同時，生物素與卵白素都具有與其他影響各自的生物活性。同時，生物素與卵白素都具有與其他標記物如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等結合的能力。目前，標記物如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等結合的能力。目前，已利用上述特性建立了卵白素已利用上述特

4、性建立了卵白素-生物素免疫染色系統，為了便生物素免疫染色系統，為了便于理解，現在統稱卵白素為抗生物素或親和素，因此，卵白于理解，現在統稱卵白素為抗生物素或親和素，因此，卵白素素-生物素免疫染色系統又稱為生物素生物素免疫染色系統又稱為生物素-抗生物素免疫組織化抗生物素免疫組織化學技術學技術 （1）石蠟切片脫蠟至水，用）石蠟切片脫蠟至水，用0.01mol/L PBS（pH=7.4）漂洗）漂洗5min3次；次； （2）滴加）滴加0.3% H2O2，37孵育孵育10min，阻斷內源性，阻斷內源性過氧化物酶；過氧化物酶； （3）用）用0.01 mol/L PBS漂洗漂洗5min3次；次； （4）滴加）滴

5、加10%正常血清正常血清/0.3%Triton X-100/0.01 mol/L PBS，37孵育孵育10 min； （5）滴加抗小鼠）滴加抗小鼠單克隆抗體（一抗單克隆抗體（一抗）37 1 h或或4過夜，過夜，PBS漂洗漂洗5min3次；次； （6）加）加生物素標記二抗生物素標記二抗（效價（效價1:200），室溫孵育），室溫孵育10 min，PBS漂洗漂洗5min3次；次； （7）滴加）滴加鏈霉素抗生物素蛋白鏈霉素抗生物素蛋白-HRP液液，室溫孵育，室溫孵育10min；PBS洗洗5min3次；次； （8）滴加滴加DAB，顯微鏡下顯色，顯微鏡下顯色510min （二）（二）ABC免疫組織化學技術

6、免疫組織化學技術 1981年，許世明等建立了年，許世明等建立了抗生物素抗生物素-生物素生物素-過過氧化物酶法氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidase complex method，簡稱，簡稱ABC法）。法）。ABC是卵白素是卵白素-生物素結合生物素結合的的HRP復合物的簡稱。復合物的簡稱。ABC復合物是先將復合物是先將HRP與生物與生物素結合，然后按一定比例將此復合物與卵白素反應，素結合，然后按一定比例將此復合物與卵白素反應，使使每一個卵白素分子上結合每一個卵白素分子上結合3個帶個帶HRP的生物素，留出的生物素，留出一個能與其它生物素結合的空位一個能與其它生物素結合的空位。

7、復合物上攜帶的。復合物上攜帶的HRP越多，則酶催化的組織化學反應也越強烈，陽性越多，則酶催化的組織化學反應也越強烈，陽性結果也越明顯結果也越明顯 （三）（三）SABC免疫組織化學技術免疫組織化學技術 鏈霉親和素是一種從鏈霉菌培養物中提取的蛋白鏈霉親和素是一種從鏈霉菌培養物中提取的蛋白質，分子量質，分子量60000， 含糖鏈。鏈霉親和素也有四個生含糖鏈。鏈霉親和素也有四個生物素親合位點，是一種更理想的抗生物素結合蛋白。物素親合位點，是一種更理想的抗生物素結合蛋白。SABC是鏈霉親和素是鏈霉親和素-生物素生物素-HRP復合物（復合物（strept-avidin-biotin-peroxidase

8、complex）的簡稱）的簡稱。SABC復合物先將復合物先將HRP與生物素結合，然后按一定比例將此與生物素結合，然后按一定比例將此復合物與鏈霉親和素反應，使每一個鏈霉親和素分子復合物與鏈霉親和素反應，使每一個鏈霉親和素分子上結合上結合3個帶個帶HRP的生物素，留出一個尚未被生物素結的生物素，留出一個尚未被生物素結合的空位，可以與各種生物素標記的抗體結合。復合合的空位，可以與各種生物素標記的抗體結合。復合物上攜帶的物上攜帶的HRP越多，則酶催化的組織化學反應也越越多，則酶催化的組織化學反應也越強烈，陽性結果也越明顯強烈，陽性結果也越明顯 n SABC SABC法是在一抗體反應后，用已結合生物素的

9、抗法是在一抗體反應后，用已結合生物素的抗IgGIgG抗體二抗橋接。然后用抗體二抗橋接。然后用SABCSABC孵育，使橋抗上的生物素與孵育，使橋抗上的生物素與SABCSABC中鏈霉親和素上的空位結合。最后仍用中鏈霉親和素上的空位結合。最后仍用HRPHRP的底物成的底物成色。在色。在SABCSABC法中，法中，一抗是特異性的一抗是特異性的，二抗是生物素標記二抗是生物素標記的二抗，三抗是的二抗，三抗是SABCSABC復合物復合物。SABCSABC復合物與橋抗體之間復合物與橋抗體之間是通過生物素結合的，因此是通過生物素結合的，因此SABCSABC復合物沒有種屬特異性，復合物沒有種屬特異性，可適用于任何

10、種屬的一抗。可適用于任何種屬的一抗。n 當然，生物素結合的二抗必須是針對一抗種屬的。因當然，生物素結合的二抗必須是針對一抗種屬的。因此，此，SABCSABC法較法較PAPPAP法操作更簡單、更靈敏。目前，法操作更簡單、更靈敏。目前，SABCSABC試試劑盒已經商品化，可以根據需要購買。劑盒已經商品化，可以根據需要購買。 （四）（四）PAP法與法與ABC法聯合（法聯合（ABPAP）技術）技術n ABPAP ABPAP使特異性一抗結合更多的酶分子，原始信號得使特異性一抗結合更多的酶分子，原始信號得 到更大的放大效應。到更大的放大效應。n （1 1）石蠟切片脫蠟至水）石蠟切片脫蠟至水 n （2 2）

11、滴加）滴加0.3% H0.3% H2 2O O2 2，80%80%甲醇抑制內源性過氧化物酶甲醇抑制內源性過氧化物酶n （3 3）用）用0.1 0.1 胰蛋白酶室溫消化胰蛋白酶室溫消化10min10minn （4 4）滴加二抗的正常血清）滴加二抗的正常血清1:101:10；n （5 5）滴加適當稀釋的一抗；）滴加適當稀釋的一抗；n （6 6）加適當稀釋的標記二抗；）加適當稀釋的標記二抗； n（7 7）滴加鼠）滴加鼠PAPPAP或兔或兔PAPPAP；n（8 8）生物素化馬抗鼠或羊抗兔；）生物素化馬抗鼠或羊抗兔；n（9 9）滴加）滴加ABCABC復合物；復合物；n（1010）滴加）滴加0.04% D

12、AB + 0.03% 0.04% DAB + 0.03% H H2 2O O2 2，n（1111）蒸餾水漂洗，蘇木精復染（必要時），脫水、透）蒸餾水漂洗，蘇木精復染（必要時），脫水、透明、封片、觀察。明、封片、觀察。n 評價評價 ABPAPABPAP法較單一法較單一PAPPAP法和法和ABCABC法更為敏感，法更為敏感，抗體稀釋度大大提高，尤其是對抗原性較弱、容易破壞或抗體稀釋度大大提高，尤其是對抗原性較弱、容易破壞或丟失的抗原，能得到較好的效果。但丟失的抗原，能得到較好的效果。但ABPAPABPAP法較單一法較單一PAPPAP法法和和ABCABC法步驟增多、操作復雜，背景著色會相應加深，而法

13、步驟增多、操作復雜，背景著色會相應加深，而且容易脫片。且容易脫片。 二、葡萄球菌蛋白二、葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）免疫組織化學技術）免疫組織化學技術 （一）（一）SPASPA的生物學特性的生物學特性 1 1生化特性生化特性 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A是一種從金黃色葡是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，簡稱蛋白萄球菌細胞壁分離的蛋白質，簡稱蛋白A A（SPASPA）。）。SPASPA存在于大部分（存在于大部分（90%90%）金葡菌，并且主要存在于血漿凝）金葡菌，并且主要存在于血漿凝固酶陽性的菌株。內含固酶陽性的菌株。內含3 3個高度相似的個高度相似的FcFc段結合區，每段結合區

14、，每區有區有5050個以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。個以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。SPASPA的羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定，其的羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定，其黏度高于球蛋白，等電點黏度高于球蛋白，等電點PI=5.1PI=5.1，天然結構十分穩定，天然結構十分穩定，在應用在應用6mol/L6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑條件下，尚能保存某鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑條件下，尚能保存某些三級結構，除去變性劑后，能自然矯正恢復原有結構。些三級結構，除去變性劑后，能自然矯正恢復原有結構。 2免疫學特性免疫學特性 SPA具有與人和許多動物如豚鼠、具有與人和許多動物如豚鼠

15、、豬、小鼠、猴等豬、小鼠、猴等IgG結合的能力。結合的能力。SPA結合部位是結合部位是Fc段段而不是而不是Fab段，結合后不影響抗體的活性。段，結合后不影響抗體的活性。SPA具有雙具有雙價結合力，價結合力，每分子每分子SPA可同時結合兩個可同時結合兩個IgG分子，也可分子，也可一方面與一方面與IgG結合，同時與標記物結合，同時與標記物（如熒光素）結合。（如熒光素）結合。另外，與另外，與SPA結合后的結合后的IgG可用可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽使鳥嘌呤鹽酸鹽使其解離。其解離。 3其他特性其他特性 SPA能引起豚鼠離體回腸的收縮，能引起豚鼠離體回腸的收縮，在吞噬反應中抑制在吞噬反應中抑制IgG調

16、理素的吞噬和殺菌作用，調理素的吞噬和殺菌作用，SPA-IgG能固定人的補體和人、狗、豬的新鮮補體等能固定人的補體和人、狗、豬的新鮮補體等 （二）（二）SPA在免疫組織化學中的應用在免疫組織化學中的應用 目前，目前，SPA已廣泛應用于免疫球蛋白的制備和已廣泛應用于免疫球蛋白的制備和分析、免疫組織化學標記、多種病原體（細菌、病毒分析、免疫組織化學標記、多種病原體（細菌、病毒和支原體等）快速診斷，作為研究免疫復合物、膜抗和支原體等）快速診斷，作為研究免疫復合物、膜抗原、膜受體和膜原、膜受體和膜IgG的固相吸附劑。本節主要介紹的固相吸附劑。本節主要介紹SPA在免疫組織化學標記中的應用。在免疫組織化學標

17、記中的應用。SPA可被多種標可被多種標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等所標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等所標記，記，應用較廣的為應用較廣的為酶標酶標SPA和金標記和金標記SPA技術技術。標記。標記SPA常用的酶為常用的酶為HRP，SPA在在PAP法中可以代替橋抗法中可以代替橋抗。 1SPA-HRP間接法染色間接法染色 （1）石蠟切片脫蠟后用）石蠟切片脫蠟后用0.5% H2O2-純甲醇液處理純甲醇液處理20min，抑制內源性過氧化物酶；抑制內源性過氧化物酶； （2）用）用Tris-HCl 緩沖液洗滌緩沖液洗滌3min2次；次； （3）加一抗血清覆蓋切片，）加一抗血清覆蓋切片

18、，37孵育孵育30 min； （4）用）用Tris-HCl 緩沖液洗滌緩沖液洗滌5min3次；次； （5）滴加適當稀釋的）滴加適當稀釋的SPA-HRP，室溫處理室溫處理30min； （6）用）用Tris-HCl 緩沖液洗滌緩沖液洗滌5min3次，次，DAB-H2O2室室溫顯色，蒸餾水漂洗；溫顯色，蒸餾水漂洗； （7）蘇木精復染，脫水、透明、封片，鏡下觀察反應）蘇木精復染，脫水、透明、封片，鏡下觀察反應產物呈棕色。產物呈棕色。 2SPA用于用于PAP法染色法染色 （1）石蠟切片脫蠟后用）石蠟切片脫蠟后用0.3% H2O2-80%純甲醇液抑制純甲醇液抑制內源性過氧化物酶內源性過氧化物酶20min；

19、 （2）加）加10%卵白蛋白卵白蛋白Tris 緩沖液，室溫作用緩沖液，室溫作用20min； （3）加一抗血清覆蓋切片，）加一抗血清覆蓋切片，37孵育孵育45 min （4）用）用Tris-HCl 緩沖液洗滌緩沖液洗滌5min； （5）滴加滴加SPA室溫處理室溫處理30min， 緩沖液洗滌緩沖液洗滌5min； （6）加加PAP復合物孵育復合物孵育30min， 緩沖液洗滌緩沖液洗滌5min； （7）加）加DAB（0.6mg/ml）和）和0.01% H2O2室溫顯色室溫顯色5min，蒸餾水漂洗；，蒸餾水漂洗； （8）蘇木精復染）蘇木精復染1min，脫水、透明、封片，鏡下觀察，脫水、透明、封片，鏡下觀

20、察反應產物呈棕色反應產物呈棕色 三、凝集素免疫組織化學技術三、凝集素免疫組織化學技術 凝集素（凝集素（lectinlectin）是一種從植物、無脊椎動物和高）是一種從植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因能凝集紅細胞等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因能凝集紅細胞（含血型物質）而得名。常用的有植物凝集素（含血型物質）而得名。常用的有植物凝集素（phytoagglutinphytoagglutin，PNAPNA），通常以其來源植物命名，如刀），通常以其來源植物命名，如刀豆素（豆素（conconvalinaconconvalina，ConAConA）、麥胚素（）、麥胚素（wh

21、eat germ wheat germ agglutininagglutinin，WGAWGA）、花生凝集素（）、花生凝集素（peanut agglutininpeanut agglutinin，PNAPNA）和大豆凝集素（）和大豆凝集素（soybean agglutininsoybean agglutinin，SBASBA）等。凝）等。凝集素不是來源或參與免疫反應的產物，但具有某些集素不是來源或參與免疫反應的產物，但具有某些“親合親合”特性，可被免疫組織化學所應用，因此，凝集素免疫組織特性，可被免疫組織化學所應用，因此，凝集素免疫組織化學應稱為凝集素組織化學化學應稱為凝集素組織化學 （一）凝

22、集素的生物學特性（一）凝集素的生物學特性 生物膜中含有一定的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形生物膜中含有一定的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。式存在。凝集素能識別凝集素能識別糖蛋白和糖肽，特別是細胞膜中復糖蛋白和糖肽，特別是細胞膜中復雜的碳水化物結構，即細胞膜表面的雜的碳水化物結構，即細胞膜表面的碳水化物決定簇碳水化物決定簇。一一種凝集素具有對某種特異性糖基專一性結合的能力，種凝集素具有對某種特異性糖基專一性結合的能力，如刀如刀豆素與豆素與-吡喃糖基甘露糖（吡喃糖基甘露糖（-D-mannopyranosyl-D-mannopyranosyl）結合，）結合，麥胚素與麥胚素與N-N-乙酰糖胺（乙酰

23、糖胺（N-acetyl glucosamineN-acetyl glucosamine）結合。因）結合。因此，此，凝集素可以作為探針，研究細胞膜上特定的糖基凝集素可以作為探針，研究細胞膜上特定的糖基。另。另外，外，凝集素具有多價結合能力，能與熒光素、生物素、酶、凝集素具有多價結合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合，膠體金和鐵蛋白等示蹤物結合，從而在光鏡或電鏡水平顯從而在光鏡或電鏡水平顯示其結合部位示其結合部位 （二）凝集素在免疫組織化學中的應用（二）凝集素在免疫組織化學中的應用 由于凝集素的以上生物學特性，目前已廣泛應用由于凝集素的以上生物學特性，目前已廣泛應用作為細胞分

24、化和成熟的標記、細胞特殊類型標記和腫瘤作為細胞分化和成熟的標記、細胞特殊類型標記和腫瘤細胞凝結素結合特性的研究。凝集素可以被多種標記物細胞凝結素結合特性的研究。凝集素可以被多種標記物如熒光素、過氧化物酶、生物素等所標記，進行免疫組如熒光素、過氧化物酶、生物素等所標記，進行免疫組織化學染色。織化學染色。 1 1直接法直接法 將標記物質直接標記在凝集素上，使將標記物質直接標記在凝集素上，使其直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂結合。本法簡便、其直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂結合。本法簡便、快速，但靈敏度不高。快速，但靈敏度不高。將熒光、將熒光、HRP或膠體金標記或膠體金標記的凝集素直接的凝集素直接用于未

25、處理組用于未處理組織，簡單迅速織，簡單迅速但敏感性差。但敏感性差。 2 2間接法間接法 將生物素化的凝集素直接與切片中的相將生物素化的凝集素直接與切片中的相應糖基結合，生物素同應糖基結合，生物素同ABCABC復合物結合。本法簡便、快速，復合物結合。本法簡便、快速，而且靈敏度高。試劑盒已商品化，可以方便購買。而且靈敏度高。試劑盒已商品化，可以方便購買。 （1 1）石蠟切片常規脫蠟至水，加）石蠟切片常規脫蠟至水，加0.01%0.01%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min20min； （2 2）TBSTBS洗滌洗滌5min5min2 2次后，在次后，在10%BSA10%BSA中浸育中浸育5min5mi

26、n，以減少非特異性染色；以減少非特異性染色； （3 3）加與生物素結合的凝集素（）加與生物素結合的凝集素（10g/ml10g/ml），孵育），孵育60min60min，TBSTBS洗滌洗滌5min5min2 2次；次； （4 4）加）加ABCABC浸育浸育60min60min，TBSTBS洗滌洗滌5min5min2 2次；次； （5 5）DABDAB顯色，流水洗滌，蘇木精復染，脫水、透明、顯色，流水洗滌，蘇木精復染，脫水、透明、封片。封片。將組織切片孵育于凝集素溶液，使之結合于切片上的糖鏈，將組織切片孵育于凝集素溶液，使之結合于切片上的糖鏈，清洗后加凝集素的特異性抗體。該抗體可用清洗后加凝集素

27、的特異性抗體。該抗體可用FITC、HRP或膠體金標記；也可不標記凝集素抗體，而將二抗標記，或膠體金標記；也可不標記凝集素抗體，而將二抗標記，或使用未標記二抗，再用或使用未標記二抗，再用PAP復合物完成染色。復合物完成染色。將凝集素用生物素標記，然后加用標記的抗生物將凝集素用生物素標記，然后加用標記的抗生物素蛋白，或素蛋白，或ABC復合物使之與生物素結合復合物使之與生物素結合 3 3糖糖- -凝集素凝集素- -糖法糖法 利用過量的凝集素與切片中特利用過量的凝集素與切片中特定的糖基結合，經過沖洗后，凝集素上還存在未被占用的定的糖基結合，經過沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結合位點，將這些未結合的部

28、位與經過氧化物酶標記的特結合位點，將這些未結合的部位與經過氧化物酶標記的特異性糖基結合，形成一個三明治樣的糖異性糖基結合，形成一個三明治樣的糖- -凝集素凝集素- -糖復合物。糖復合物。本法特異性強、靈敏度高，既不像本法特異性強、靈敏度高，既不像ABCABC法那樣要結合生物法那樣要結合生物素，也不需要像素，也不需要像PAPPAP法那樣制備抗體。法那樣制備抗體。 （1 1）石蠟切片脫蠟后用）石蠟切片脫蠟后用0.3% H0.3% H2 2O O2 2- -純甲醇液處理純甲醇液處理20min20min，抑制內源性過氧化物酶；抑制內源性過氧化物酶； （2 2）用凝集素室溫孵育）用凝集素室溫孵育30mi

29、n 30min ，TBSTBS洗滌洗滌3min3min2 2次；次； （3 3）加）加10g/ml HRP10g/ml HRP標記的糖液，室溫孵育標記的糖液，室溫孵育30 min30 min，TBSTBS洗滌洗滌5min5min2 2次；次； （4 4）DAB-HDAB-H2 2O O2 2顯色，蒸餾水漂洗，脫水、透明、封片。顯色，蒸餾水漂洗，脫水、透明、封片。將過量凝集素加于組織切將過量凝集素加于組織切片上（以保證凝集素的結片上（以保證凝集素的結合位點被組織上的糖基不合位點被組織上的糖基不完全占據）再加糖基化的完全占據）再加糖基化的標記物（如巖藻糖基標記物（如巖藻糖基Fuc-HRP)，其中的

30、糖基，其中的糖基將結合于未被占據的凝集將結合于未被占據的凝集素結合位點，然后顯示標素結合位點，然后顯示標記物。由于目前發現的糖記物。由于目前發現的糖基化的標記物種類不多，基化的標記物種類不多，故夾層發的使用有限。故夾層發的使用有限。 第五節第五節 免疫金銀及鐵標記技術免疫金銀及鐵標記技術n 應用膠體金作為標記物的免疫金染色和免疫應用膠體金作為標記物的免疫金染色和免疫金銀染色方法，在光鏡和電鏡下可以進行單標記、金銀染色方法，在光鏡和電鏡下可以進行單標記、雙重標記或多重標記，觀察組織和細胞結構，定雙重標記或多重標記，觀察組織和細胞結構，定性、定位和定量研究。性、定位和定量研究。n 一、膠體金的基本

31、概念一、膠體金的基本概念 n 1 1分散體系分散體系 體系是一定空間范圍內作為研體系是一定空間范圍內作為研究對象的物質，某一種或幾種物質分散到另一種物質究對象的物質，某一種或幾種物質分散到另一種物質中所組成的體系稱為分散體系。被分散的物質稱為分中所組成的體系稱為分散體系。被分散的物質稱為分散相或分散質，而另一種物質稱為分散介質。分散體散相或分散質，而另一種物質稱為分散介質。分散體系的某些性質因分散相質點的大小而改變，可分為三系的某些性質因分散相質點的大小而改變，可分為三類：類：n （1 1）離子分散體系：分散相以小分子或離子狀態）離子分散體系：分散相以小分子或離子狀態分散，這種溶液具有高度穩定

32、性，無論放置多久，分分散，這種溶液具有高度穩定性，無論放置多久，分散相顆粒都不會因重力而下沉，不會從容液中分散出散相顆粒都不會因重力而下沉，不會從容液中分散出來來 n （2 2）膠體分散體系：分散相顆粒大小在）膠體分散體系：分散相顆粒大小在1 110nm10nm之間，膠體溶液外觀透明不渾濁，普通顯微鏡之間，膠體溶液外觀透明不渾濁，普通顯微鏡下看不見其分散相粒子，不易受重力影響與分散介下看不見其分散相粒子，不易受重力影響與分散介質分離而沉淀，但其中的溶膠粒子有聚結變大的傾質分離而沉淀，但其中的溶膠粒子有聚結變大的傾向，即具有聚結不穩定性。向，即具有聚結不穩定性。n （3 3）粗分散體系：分散相顆

33、粒由許多分子組成，）粗分散體系：分散相顆粒由許多分子組成，因粒子較大，肉眼或顯微鏡即可看到，不穩定，極因粒子較大，肉眼或顯微鏡即可看到，不穩定，極易因重力作用而自動沉降，外觀渾濁不透明。易因重力作用而自動沉降，外觀渾濁不透明。n 2 2膠體金的一般形狀膠體金的一般形狀 膠體金也稱金溶膠，是膠體金也稱金溶膠，是指分散相粒子直徑在指分散相粒子直徑在l l150nm150nm之間的金溶膠，是由金之間的金溶膠，是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液，具有一般溶膠鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液，具有一般溶膠的特性。屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅的特性。屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色（

34、顆粒越大，顏色越深）。色（顆粒越大，顏色越深）。n 膠體金可以作為標記物用于免疫組織化學，近膠體金可以作為標記物用于免疫組織化學，近1010多年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技多年來膠體金標記已經發展為一項重要的免疫標記技術。膠體金免疫分析在藥物檢測、生物醫學等許多領術。膠體金免疫分析在藥物檢測、生物醫學等許多領域的研究已經得到發展，并越來越受到相關研究領域域的研究已經得到發展，并越來越受到相關研究領域的重視的重視n 3. 膠體金標記蛋白膠體金標記蛋白n 溶液的溶液的pHpH等于或稍高于蛋白質等電點時，蛋白質呈等于或稍高于蛋白質等電點時，蛋白質呈中性，此時蛋白質分子與膠體金顆粒之間的

35、靜電作用較中性，此時蛋白質分子與膠體金顆粒之間的靜電作用較小，但蛋白質分子的表面張力最大，處于一種微弱的水小，但蛋白質分子的表面張力最大，處于一種微弱的水化狀態，易于吸附于金顆粒的表面。由于蛋白質分子牢化狀態，易于吸附于金顆粒的表面。由于蛋白質分子牢固地結合在金顆粒的表面，形成一個蛋白層，阻止了膠固地結合在金顆粒的表面，形成一個蛋白層，阻止了膠體金顆粒間的相互接觸，使膠體金溶液處于穩定狀態。體金顆粒間的相互接觸，使膠體金溶液處于穩定狀態。為防止蛋白質與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋為防止蛋白質與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白、卵蛋白、聚乙二醇或明膠做穩定劑。白、卵蛋白、聚乙二醇或明膠

36、做穩定劑。n 二、免疫金銀組織化學技術二、免疫金銀組織化學技術n （一）免疫金染色（一）免疫金染色n 1 1免疫金法免疫金法 免疫金法（免疫金法（IGSIGS）染色程序簡）染色程序簡單，無需顯色就能檢測細胞表面的抗原，又能檢單，無需顯色就能檢測細胞表面的抗原，又能檢測細胞內抗原。陽性部位顯紅色，一般要求膠體測細胞內抗原。陽性部位顯紅色，一般要求膠體金顆粒直徑大于金顆粒直徑大于20nm20nm，濃度較高。分為直接法，濃度較高。分為直接法（標記一抗）和間接法。用（標記一抗）和間接法。用IGSIGS定位細胞抗原一般定位細胞抗原一般采用間接法。采用間接法。n （二）免疫金銀法（二）免疫金銀法n 免疫金

37、銀法（免疫金銀法（IGSSIGSS）的基本原理是通過免疫反應沉）的基本原理是通過免疫反應沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子（苯二酚還原劑將銀離子（Ag+Ag+）還原成銀原子（）還原成銀原子（AgoAgo）。）。被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個被還原的銀原子圍繞金顆粒形成一個“銀殼銀殼”，“銀殼銀殼”一旦形成本身也具有催化作用，從而使更多銀離子還原，一旦形成本身也具有催化作用，從而使更多銀離子還原，促使促使“銀殼銀殼”越來越大，最終抗原位置清楚放大。越來越大，最終抗原位置清楚放大。n IGSSIGSS優點：用于光

38、鏡和電鏡觀察；敏感性高；優點：用于光鏡和電鏡觀察；敏感性高；定位準確；方法簡便、安全；成本較低，標本可定位準確；方法簡便、安全；成本較低，標本可長期保存長期保存n （三）彩色免疫金銀法（三）彩色免疫金銀法（CIGSSCIGSS） 是在是在IGSSIGSS基基礎上發展起來的，基本原理與彩色顯影相似。礎上發展起來的，基本原理與彩色顯影相似。IGSSIGSS方方法在抗原位點處生成銀顆粒，經鐵氰化鉀與溴化鉀的法在抗原位點處生成銀顆粒，經鐵氰化鉀與溴化鉀的作用即被氧化成溴化銀，后者與彩色顯影劑接觸后即作用即被氧化成溴化銀，后者與彩色顯影劑接觸后即被還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其氧被還原成金屬

39、銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其氧化產物使彩色呈色劑由無色變成有色染料，沉積在銀化產物使彩色呈色劑由無色變成有色染料，沉積在銀顆粒的部位，金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通顆粒的部位，金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以，不與組織發過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以，不與組織發生非特異性吸附。生非特異性吸附。 （四）免疫金銀組織化學技術的優點（四）免疫金銀組織化學技術的優點1.1.膠體金制備簡單膠體金制備簡單2.2.標記簡單，抗體生物活性不受影響標記簡單，抗體生物活性不受影響3.3.特異性強特異性強4.4.敏感性高敏感性高5.5.定位準確定位準確6.6.適應性廣

40、適應性廣7.7.易于多重雙重標記易于多重雙重標記n 三、免疫膠體鐵組織化學技術三、免疫膠體鐵組織化學技術n 膠體鐵（膠體鐵（ferric colloidferric colloid）是一種陽離子膠體，）是一種陽離子膠體，可以通過普魯士藍反應呈色，其顆粒有一定的大小和可以通過普魯士藍反應呈色，其顆粒有一定的大小和電子密度，最初用于光鏡和電鏡下定位組織中的陰離電子密度，最初用于光鏡和電鏡下定位組織中的陰離子部位，后來用于標記抗體分子，應用于免疫組織化子部位，后來用于標記抗體分子，應用于免疫組織化學技術。本法特異性強、敏感性高、背景清晰。學技術。本法特異性強、敏感性高、背景清晰。n 目前常用水合聯胺

41、目前常用水合聯胺-二甲砷酸二甲砷酸-FeCl3煮沸法制備微煮沸法制備微細顆粒的膠體鐵，該方法制備的膠體鐵呈棕紅色，顆細顆粒的膠體鐵，該方法制備的膠體鐵呈棕紅色，顆粒大小粒大小1nm左右左右 。n 光鏡下，陽性部位呈藍色，細胞核呈紅色光鏡下，陽性部位呈藍色，細胞核呈紅色 第六節第六節 免疫組化雙標技術免疫組化雙標技術 應用免疫細胞化學方法在同一張組織、細胞片上，同時應用免疫細胞化學方法在同一張組織、細胞片上，同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，稱為免疫雙重或多重或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分，稱為免疫雙重或多重標記技術。標記技術。光鏡下可通過標記物或其反應生成物的顏色來標記光鏡下可通過標

42、記物或其反應生成物的顏色來標記不同的抗原成分，電鏡下則可通過標記物顆粒的大小來表示不不同的抗原成分，電鏡下則可通過標記物顆粒的大小來表示不同的抗原成分。本章主要介紹光鏡免疫雙重或多重標記技術同的抗原成分。本章主要介紹光鏡免疫雙重或多重標記技術。 一、基本原理和方法一、基本原理和方法 目前已建立了許多方法，根據其作用方式和原理的不同，目前已建立了許多方法，根據其作用方式和原理的不同，可以分為洗脫法和非洗脫法兩大類。可以分為洗脫法和非洗脫法兩大類。 （一）洗脫法（一）洗脫法 一般用于光鏡下間接法所做的雙標。一般用于光鏡下間接法所做的雙標。基本原理基本原理是在是在第一種染色完成后，用第一種染色完成后

43、，用酸性溶液洗脫酸性溶液洗脫這種染色在切片上這種染色在切片上形成的抗原抗體復合物，從而避免與下一種抗體系統發形成的抗原抗體復合物，從而避免與下一種抗體系統發生交叉反應。按洗脫效果，可以分為以下兩種情況。生交叉反應。按洗脫效果，可以分為以下兩種情況。 1洗脫第一種染色中的抗原抗體復合物，但保留洗脫第一種染色中的抗原抗體復合物，但保留顯色反應的生成物顯色反應的生成物，然后做下一種染色，并采用不同顏，然后做下一種染色，并采用不同顏色的反應生成物來標示第二種抗原。這樣，色的反應生成物來標示第二種抗原。這樣，兩種顏色可兩種顏色可同時并存于同一組織片上同時并存于同一組織片上顯示兩種抗原。顯示兩種抗原。 2

44、洗脫第一種染色中的抗原抗體復合物及顯色反洗脫第一種染色中的抗原抗體復合物及顯色反應生成物，再做下一種染色。應生成物，再做下一種染色。這時第二種染色實際上是在這時第二種染色實際上是在回復為空白的組織片上重新進行，并用不同顏色的反應生回復為空白的組織片上重新進行，并用不同顏色的反應生成物與前一種結果相區別。這種方法得到的成物與前一種結果相區別。這種方法得到的兩種染色陽性兩種染色陽性結果是先后而不是同時并存在同一組織片上結果是先后而不是同時并存在同一組織片上。要比較和了。要比較和了解它們之間的關系，必須在完成第一種染色后先拍照，然解它們之間的關系，必須在完成第一種染色后先拍照，然后在第二種染色后找到

45、同一區域再次拍照，比較兩次照片后在第二種染色后找到同一區域再次拍照，比較兩次照片的結果。的結果。 （二）非洗脫法二）非洗脫法 在染色過程中，在染色過程中，不用洗脫不用洗脫第一種染色的抗原第一種染色的抗原抗體復合物及顯色反應產物，而用多種不同的技抗體復合物及顯色反應產物，而用多種不同的技術方法來避免與第二種染色抗體系統的交叉反應，術方法來避免與第二種染色抗體系統的交叉反應，即非洗脫法。較常用的非洗脫法有以下幾種。即非洗脫法。較常用的非洗脫法有以下幾種。 1直接法直接法 把把不同顏色的標記物不同顏色的標記物分別分別標記到標記到各個特異性抗體（一抗）各個特異性抗體（一抗）上，采用直接法染色，上，采用

46、直接法染色，特異性抗體分別與相應的抗原結合，使抗原由不特異性抗體分別與相應的抗原結合，使抗原由不同的標記物顯示出來，實現雙標或多標（圖同的標記物顯示出來，實現雙標或多標（圖6-16-1）。）。 圖圖6-1 直接法免疫雙重染色原理直接法免疫雙重染色原理X X、Y Y為兩種抗原為兩種抗原 HRPHRP為辣根過氧化物酶為辣根過氧化物酶 APAP為堿性磷酸酶為堿性磷酸酶 2間接法間接法-異種動物抗體法異種動物抗體法 不同種動物不同種動物IgG的的Fc段抗原有種屬特異性，因此相應的抗體段抗原有種屬特異性，因此相應的抗體不會發生交叉反應。用間接法染色時，不會發生交叉反應。用間接法染色時，不同的一不同的一抗

47、（如兔抗抗（如兔抗X抗原的抗體和豚鼠抗抗原的抗體和豚鼠抗Y抗原的抗體）抗原的抗體）可混合在一起使用，可混合在一起使用，不同的二抗（如羊抗兔不同的二抗（如羊抗兔IgG和豬抗豚鼠和豬抗豚鼠IgG）也可混合在一起應用，也可混合在一起應用，不同種不同種屬的一抗和二抗各自與相應的抗原（屬的一抗和二抗各自與相應的抗原（X和和Y）反）反應應，從而將兩種抗原同時顯示出來（圖，從而將兩種抗原同時顯示出來（圖6-2A）。）。 圖圖6-2 間接異種動物抗體法和雙重免疫染色原理間接異種動物抗體法和雙重免疫染色原理 3間接法間接法-同種動物抗體法同種動物抗體法 也稱分步也稱分步固定法。固定法。做第一種染色時，在一抗（兔

48、抗做第一種染色時，在一抗（兔抗X）與）與組織抗原組織抗原X結合后，結合后，用第一種標記二抗（如用第一種標記二抗（如FITC-羊抗兔羊抗兔IgG）飽和飽和一抗（兔抗一抗（兔抗X）上的抗）上的抗原決定簇，原決定簇，這就排除了第二種染色時所用的二抗這就排除了第二種染色時所用的二抗（如（如TRITC-羊抗兔羊抗兔IgG）再與之結合的可能。）再與之結合的可能。此時由于此時由于二抗過量二抗過量，每個，每個FITC-羊抗兔羊抗兔IgG分子分子上的上的兩個抗原結合部位（兩個抗原結合部位（Fab段）只有其中一個段）只有其中一個與一抗上的抗原決定簇結合，另一個處于游離狀與一抗上的抗原決定簇結合，另一個處于游離狀態

49、，有態，有可能與下一種染色中的一抗（兔抗可能與下一種染色中的一抗（兔抗Y）交）交叉反應。因此，叉反應。因此，在完成第一種染色后，用多聚甲在完成第一種染色后，用多聚甲醛蒸氣處理組織片，醛蒸氣處理組織片，使使二抗的游離抗原結合部位二抗的游離抗原結合部位失活失活，即可消除第二種染色中所用的一抗（兔抗，即可消除第二種染色中所用的一抗（兔抗Y）與之發生交叉反應的可能，使各種免疫染色）與之發生交叉反應的可能，使各種免疫染色所用抗體都不再會有交叉反應，從而可以一種接所用抗體都不再會有交叉反應，從而可以一種接一種地進行多種免疫顯色（圖一種地進行多種免疫顯色（圖6-3）。 圖圖6-3 間接法同種動物抗體法（分步

50、固定法）間接法同種動物抗體法（分步固定法）多重免疫染色原理多重免疫染色原理 4標記抗原法標記抗原法: : 應用這一方法前，首先應用這一方法前，首先用不同的用不同的標記物分別標記與待檢抗原相同的純抗原。標記物分別標記與待檢抗原相同的純抗原。染色時先用染色時先用未標記的未標記的特異性抗體與組織抗原反應，特異性抗體與組織抗原反應，由于由于抗體過量抗體過量及及空間結構的原因，每個空間結構的原因，每個特異性抗體特異性抗體IgG分子分子中只有中只有一個一個抗原結合部位（抗原結合部位（Fab段）段）與組織抗原結合，另一個與組織抗原結合，另一個則與則與后來所用的后來所用的標記純抗原結合標記純抗原結合，從而顯示

51、出相應的組織抗，從而顯示出相應的組織抗原的部位。采用本法時，即使抗體不純也不會影響結果原的部位。采用本法時，即使抗體不純也不會影響結果的特異性，因為標記好的純抗原只與相應抗體結合，從的特異性，因為標記好的純抗原只與相應抗體結合，從而使組織中相應的抗原分別得到特異性顯示（圖而使組織中相應的抗原分別得到特異性顯示（圖6-4）。）。圖圖6-4 標記抗原法免疫雙重染色原理標記抗原法免疫雙重染色原理 5其他方法其他方法 免疫熒光法和免疫酶法免疫熒光法和免疫酶法的敏感性不同，可以的敏感性不同，可以組合應用組合應用實現雙標。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感性高，實現雙標。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感

52、性高，一抗可以高度稀釋，顯色反應后，二抗又被顯色反應生成一抗可以高度稀釋，顯色反應后，二抗又被顯色反應生成物包繞，不易與下一重的一抗相結合。此后以免疫熒光法物包繞，不易與下一重的一抗相結合。此后以免疫熒光法作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗體系統不會與前作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗體系統不會與前一重染色中高度稀釋的抗體交叉反應，就能分別標示出不一重染色中高度稀釋的抗體交叉反應，就能分別標示出不同抗原。同樣，還可將免疫金銀法與上兩種方法做不同組同抗原。同樣，還可將免疫金銀法與上兩種方法做不同組合，或將免疫金銀法與免疫金法組合來實現雙標。合，或將免疫金銀法與免疫金法組合來實現雙標。 二、

53、免疫熒光雙標技術免疫熒光雙標技術 最適合觀察存在于同一細胞內的不同抗原。最適合觀察存在于同一細胞內的不同抗原。不同的熒光不同的熒光素在相應的光波激發下會呈現不同的顏色，素在相應的光波激發下會呈現不同的顏色，例如異硫氰熒光例如異硫氰熒光素素（FITC）呈綠色，）呈綠色，異硫氰酸四甲基羅丹明異硫氰酸四甲基羅丹明（TRITC）呈）呈紅色熒光紅色熒光。把它們分別標記在不同的抗體上，各自與相應的。把它們分別標記在不同的抗體上，各自與相應的抗原相結合，就能實現用不同顏色顯示不同的抗原。由于每抗原相結合，就能實現用不同顏色顯示不同的抗原。由于每種熒光素在特定波長的光波激發下才呈現相應的熒光（種熒光素在特定波

54、長的光波激發下才呈現相應的熒光（如如FITC在在490nm光波激發下呈綠色，光波激發下呈綠色，TRITC在在546nm光波激光波激發下呈紅色），發下呈紅色），用熒光顯微鏡觀察雙標陽性結果時，可以依用熒光顯微鏡觀察雙標陽性結果時，可以依次次選用特定波長的激發濾光片選用特定波長的激發濾光片分別觀察。分別觀察。 要精確地比較陽性結果，則需用兩次曝光的技術，要精確地比較陽性結果，則需用兩次曝光的技術，選用彩色底片，先對一種顏色熒光顯示的陽性結果拍選用彩色底片，先對一種顏色熒光顯示的陽性結果拍照，然后轉換激發濾光片，對另一種顏色熒光顯示的照，然后轉換激發濾光片，對另一種顏色熒光顯示的陽性結果作第二次曝光

55、，此時不可移動載玻片，以保陽性結果作第二次曝光，此時不可移動載玻片，以保證切片上不同顏色代表的相應抗原，可以分析比較它證切片上不同顏色代表的相應抗原，可以分析比較它們相互間的關系。也可以不移動切片，同時拍兩張不們相互間的關系。也可以不移動切片，同時拍兩張不同顏色熒光照片，比較抗原存在部分，對處于同一細同顏色熒光照片，比較抗原存在部分，對處于同一細胞內的抗原，用這種方法觀察結果較好。有時在同一胞內的抗原，用這種方法觀察結果較好。有時在同一波長觀察兩種熒光，并進行照相也能得到較滿意的結波長觀察兩種熒光，并進行照相也能得到較滿意的結果。果。 （一）洗脫法（一）洗脫法 用同種動物產生的特異性抗血清為一

56、抗（如兔抗用同種動物產生的特異性抗血清為一抗（如兔抗X抗原及兔抗抗原及兔抗Y抗原血清），二抗也由一種動物產生（如抗原血清），二抗也由一種動物產生（如羊抗兔羊抗兔IgG），但用不同顏色的熒光素分別標記（如），但用不同顏色的熒光素分別標記（如FITC-羊抗兔羊抗兔IgG及及TRITC-羊抗兔羊抗兔IgG）。 1 1設備與試劑設備與試劑 （1 1）濕盒，冰箱和烤箱。）濕盒，冰箱和烤箱。 （2 2）伊文藍溶液：取伊文藍）伊文藍溶液：取伊文藍lglg溶解于溶解于l00ml PBSl00ml PBS中，加中，加入入1%NaN1%NaN3 3 1m11m1。過濾后。過濾后 貯存于貯存于44冰箱中。用前取冰箱

57、中。用前取0.1ml0.1ml，加加PBS 9.9mlPBS 9.9ml稀釋成稀釋成0.01%0.01%濃度使用。濃度使用。n （3）洗脫液：）洗脫液：12.5%高錳酸鉀（高錳酸鉀（KMn2O4）1ml，5%硫酸（硫酸（H2SO4）1ml，加蒸餾水，加蒸餾水140ml混勻而成。混勻而成。n （4）0.5%焦亞硫酸納還原液：焦亞硫酸納還原液：500mg焦亞硫酸鈉焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）加蒸餾水至）加蒸餾水至l00ml。n （5）甲基綠溶液：）甲基綠溶液：0.1%甲基綠甲基綠4m1加入加入PBS 36ml混混勻。勻。n （6）緩沖甘油：純甘油（分析純）緩沖甘油：純甘油（分析純）20ml，加入，

58、加入0.5mol/L碳酸緩沖液（碳酸緩沖液（pH9.5）20m1，充分混勻，待其，充分混勻，待其中氣泡完全消失，即可使用。中氣泡完全消失，即可使用。n （7）0.5mol/L碳酸緩沖液（碳酸緩沖液（pH9.5）：將）：將NaHCO3 3.7g，Na2CO2 0.6g溶解于溶解于l00m1蒸餾水中，混合，調蒸餾水中，混合，調pH至至9.5。n 2操作步驟操作步驟n （1）石蠟切片經二甲苯脫蠟，降乙醇至水；固定組織）石蠟切片經二甲苯脫蠟，降乙醇至水；固定組織的恒冷切片，直接入的恒冷切片，直接入0.01mol/L PBS；新鮮組織的恒冷切片，；新鮮組織的恒冷切片，室溫干燥室溫干燥3060min，在，

59、在100%冷丙酮內固定冷丙酮內固定5l0min后入后入PBS，組織周邊擦干。，組織周邊擦干。n （2）滴加適當稀釋度的免疫血清，在濕盒、）滴加適當稀釋度的免疫血清，在濕盒、37溫箱溫箱中放置中放置3060min，或在，或在4冰箱中過夜。冰箱中過夜。n （3）PBS洗洗3次，每次次，每次5min，吸水紙吸去殘留液。，吸水紙吸去殘留液。n （4）滴加適當稀釋度的間接熒光抗體（用）滴加適當稀釋度的間接熒光抗體（用0.01%伊文伊文藍溶液稀釋，以消除非特異性自發熒光），在濕盒中藍溶液稀釋，以消除非特異性自發熒光），在濕盒中37放置放置3060min。 （5）PBS洗洗2次，每次次，每次5min，再用蒸

60、餾水洗，再用蒸餾水洗1min。（6）甘油緩沖液封固，熒光顯微鏡觀察，拍照。）甘油緩沖液封固，熒光顯微鏡觀察，拍照。（7）PBS泡數分鐘，去除封固，蒸溜水洗泡數分鐘，去除封固，蒸溜水洗50min。（8）入洗脫液，洗脫時間隨切片厚度而定，一般）入洗脫液，洗脫時間隨切片厚度而定，一般為為15min，較厚的振動切片，需，較厚的振動切片，需10min以上。以上。（9）切片置入）切片置入0.5%焦亞硫酸鈉液焦亞硫酸鈉液30s。（10）流水沖洗）流水沖洗1020min，蒸餾水浸，蒸餾水浸5min。（11）重復步驟）重復步驟26進行第二重免疫熒光染色。進行第二重免疫熒光染色。n 若需要，可用甲基綠套染核，染色