1、動動 物物 乳乳 腺腺 生生 物物 反反 應應 器器 1;.2轉基因動物技術轉基因動物技術加快家畜品種的改良速度，提高肉、加快家畜品種的改良速度，提高肉、奶、蛋的產量和品質，生產珍貴的藥奶、蛋的產量和品質，生產珍貴的藥用蛋白用蛋白,為大量患者造福。為大量患者造福。 轉基因動物最誘人的前景是作為轉基因動物最誘人的前景是作為生物反應生物反應器器，利用它生產人類所需要的生物活性產，利用它生產人類所需要的生物活性產品或藥物，其常用方法是把目的基因在血品或藥物，其常用方法是把目的基因在血液循環系統、唾液腺或乳腺等器官或組織液循環系統、唾液腺或乳腺等器官或組織中表達，從而獲得人類需要的目的產物。中表達，從

2、而獲得人類需要的目的產物。 根據目的蛋白表達部位的根據目的蛋白表達部位的不同可分為不同可分為乳腺生物反應乳腺生物反應器器、血、血 液生物液生物 反反 應應 器器 、卵卵 生生 物物 反反 應應 器器 、尿、尿 生生 物物 反反 應器、精囊腺生物反應應器、精囊腺生物反應器、唾液腺生物反應器等。器、唾液腺生物反應器等。3乳腺生物反應器的原理及步驟乳腺生物反應器的原理及步驟乳腺生物反應器的研究進展乳腺生物反應器的研究進展乳腺生物反應器的存在的問題乳腺生物反應器的存在的問題乳腺生物反應器的優點及其應用乳腺生物反應器的優點及其應用4原理原理: 應用重組應用重組 DNA技術和轉基因技術，將目的基因轉移到尚

3、處于原核階段的動物胚胎技術和轉基因技術，將目的基因轉移到尚處于原核階段的動物胚胎中，經胚胎移植得到轉基因乳腺表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。中，經胚胎移植得到轉基因乳腺表達多肽藥物、工業酶、疫苗和抗體等蛋白的技術。 外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調控區，即需要一個引外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調控區，即需要一個引導泌乳期乳蛋白基因表達的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調節序列控制導泌乳期乳蛋白基因表達的序列，這樣才能將外源基因置于乳腺特異性調節序列控制之下，使其在乳腺中表達再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。之下，使其在乳腺

4、中表達再通過回收奶獲得具有生物活性的目的蛋白。乳腺生物反應器的原理及步驟乳腺生物反應器的原理及步驟5步驟6轉基因動物生產紅細胞生成素（轉基因動物生產紅細胞生成素（ EPO ）將將EPO DNA分別以分別以Hind和和BamHI酶切，回收酶切，回收5.4kb的的Hind/BamHI片段，插片段，插入入pGEM-7zf(+)載體，再將載體，再將867bp的的BLG啟動子插入啟動子插入EPO基因之前基因之前EcoR、ClaI位點，位點，構建表達載體構建表達載體pGEM-3zf(+)-LG-EPO。通過顯微注射方法得到轉基因小鼠，其。通過顯微注射方法得到轉基因小鼠，其乳腺中的乳腺中的EPO含量可達含量

5、可達0.5g/ml。7 20 20世紀世紀8080年代末提出動物乳腺生物反應器的設想年代末提出動物乳腺生物反應器的設想 1987 1987年，年，GordonGordon等首次報道在小鼠的乳腺中表達了人的組織纖溶酶原激活劑等首次報道在小鼠的乳腺中表達了人的組織纖溶酶原激活劑(tPA)(tPA)基因。基因。 1991 1991年，年，WrightGWrightG等培育成乳腺特異表達人抗胰蛋白酶轉基因綿羊，表達水平高達等培育成乳腺特異表達人抗胰蛋白酶轉基因綿羊，表達水平高達35g/L35g/L，在世界范圍內引起了極大的轟動。在世界范圍內引起了極大的轟動。 1991 1991年，年，BremBrem

6、等報道乳腺表達牛凝乳酶的轉基因兔，表達等報道乳腺表達牛凝乳酶的轉基因兔，表達 水平達到水平達到1 110g/L10g/L。 1992 1992年，年，Ve-landeVe-lande：等報道了乳腺表達人：等報道了乳腺表達人C C蛋白的轉基因豬，表達水平達到蛋白的轉基因豬，表達水平達到1g/L1g/L以上。以上。 目前，從轉基因動物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶目前，從轉基因動物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶和人和人C C蛋白等基因工程產品已蛋白等基因工程產品已進入臨床試驗階段，并已初步形成以轉基因動物乳腺為主要生產手段的醫藥產業。進入臨床試驗階段，并已初步形成以轉基因動物乳腺為主要生產

7、手段的醫藥產業。乳腺生物反應器的研究進展乳腺生物反應器的研究進展國外研究進展國外研究進展820世紀世紀80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應器的構年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反應器的構 想想 ，并成功獲得表達乙肝病毒，并成功獲得表達乙肝病毒表面抗原的轉基因兔表面抗原的轉基因兔 ，為，為 我國通過轉基因動物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎。我國通過轉基因動物的途徑獲得珍貴藥物奠定了基礎。1995年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達了人的基因；年，我國首次在小鼠乳腺中成功地表達了人的基因；1996年年10月上海醫學遺傳研究所與復旦大學合作研制成功的能在乳腺中表達人凝血因子月上海醫學遺傳研究所與復旦

8、大學合作研制成功的能在乳腺中表達人凝血因子的轉基因羊。的轉基因羊。2005年，國家年，國家 “ “863”計劃組利用轉基因體細胞克隆技術計劃組利用轉基因體細胞克隆技術 ，分別獲得了，分別獲得了 轉人乳鐵蛋白、轉人乳鐵蛋白、轉人溶菌酶、轉乳清白蛋白等轉人基因轉人溶菌酶、轉乳清白蛋白等轉人基因 蛋白，其中人乳蛋白，其中人乳 鐵蛋白和人鐵蛋白和人-乳清白蛋白是乳清白蛋白是國際上首次國際上首次 利用轉基因克隆牛而獲得的。利用轉基因克隆牛而獲得的。 雖然我國在該項技術上取得了較大進展，雖然我國在該項技術上取得了較大進展，但還處于探索階段，與國外還有一定的差距。但還處于探索階段，與國外還有一定的差距。 自

9、國家自國家“863”計劃對計劃對 “ “動物乳腺生物動物乳腺生物反應器應用研究反應器應用研究”立項后，逐步受到有關部門和企業界的重視，研究和開發的力度加立項后，逐步受到有關部門和企業界的重視，研究和開發的力度加 強，前景非常樂觀。強，前景非常樂觀。國內研究進展國內研究進展9表達產物能充分修飾且具有穩定的生物活性表達產物能充分修飾且具有穩定的生物活性 利用DNA重組技術的微生物來生產的藥用蛋白,由于細菌等微生物不能進行蛋白質合成后的加工, 因而生物活性低, 并且具有免疫原性。產品成本低產品成本低,可以大規模生產可以大規模生產 藥物其效率是利用以大腸桿菌和動物細胞培養技術的100倍產品質量高產品質

10、量高,易提純易提純 生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣,極易提純。乳腺生物反應器的優點及其應用乳腺生物反應器的優點及其應用10應用應用組織纖溶酶原激活劑組織纖溶酶原激活劑(TPA)：由美國遺傳技術公司開發的血栓溶解劑，：由美國遺傳技術公司開發的血栓溶解劑，1987 年年11月經聯邦月經聯邦食品及藥物管理局食品及藥物管理局(FDA)批準上市。批準上市。1988年的銷售額為年的銷售額為1.51.6億美元，億美元，1989年為年為1.81.9億美元。今后每年的市場銷售額約為億美元。今后每年的市場銷售額約為22.5億美元。億美元。 重組人抗凝血酶重組人抗凝血酶ii:世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥

11、物。重組人抗凝血酶世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。重組人抗凝血酶iii具具有抑制血液中凝血酶活性，預防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有抑制血液中凝血酶活性，預防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。有顯著效果。2010年，轉基因動物生產的重組蛋白產品銷售額達到年，轉基因動物生產的重組蛋白產品銷售額達到350 億美元，生產的藥物將占整個基億美元，生產的藥物將占整個基因工程藥物種類的因工程藥物種類的90%以上。以上。11目的基因在動物基因中的整合問題目的基因在動物基因中的整合問題 由于目的基因在動物基因中的整合是隨機的，因此包括整合位點、整合的由于目

12、的基因在動物基因中的整合是隨機的，因此包括整合位點、整合的拷貝數等機制還不清楚。所以易發生調節失控、遺傳不穩定、表達率不高等問題。拷貝數等機制還不清楚。所以易發生調節失控、遺傳不穩定、表達率不高等問題。乳腺生物反應器的存在的問題乳腺生物反應器的存在的問題12轉基因動物的成活率低轉基因動物的成活率低 在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達載體的構建及轉基因技術的關鍵在目的基因的分離和改造，乳腺特異表達載體的構建及轉基因技術的關鍵性技術上存在缺陷，無法保證對基因的定點整合，因此轉基因動物常會出現繁殖力下性技術上存在缺陷，無法保證對基因的定點整合，因此轉基因動物常會出現繁殖力下降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷降、胚胎早期死亡等各種生理及病理缺陷 。13安全性安全性 動物體內雖然可以對外源蛋白進行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在動物體內雖然可以對外源蛋白進行翻譯后修飾，但由于牛、羊等家畜存在自身機體保護系統可對所有外源性物質產生排斥反應，如出現蛋白質水解等問題。自身機體保護系統可對所有外源性物質產生排斥反應，如出現蛋白質水解等問題。 此此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產品的安全性構成了極大的威脅，外乳汁中可能含有的微生物及不完全修飾的多肽都對產品的安全性構成了極