1、艾塞那肽長效緩釋微球的制備及體內藥效學研究劉斌1,2，董慶光1，王夢舒1，李純1，孔維1,2，陳妍1*(1.吉林大學生命科學學院，長春 130012； 2.吉林大學超分子結構與材料國家重點實驗室，長春 130012.)摘要：目的 制備艾塞那肽長效緩釋微球，并考察其理化性質、體外釋放特性及體內藥效學。方法 采用復乳溶劑揮發法（W/O/W）制備包裹艾塞那肽的聚乳酸羥基乙酸嵌段共聚物（PLGA）微球；考察微球的粒徑分布、表面形態、載藥量和包封率； 用microBCA試劑盒測定微球的體外釋放速率；考察了微球在糖尿病模型小鼠體內的降血糖作用。結果 微球外觀光滑圓整，分散性好，艾塞那肽載藥量為3，包封率為

2、75；微球40d之內體外累積釋放達到88，其體外釋放曲線近似零級釋放模式；體內藥效學實驗結果顯示，40d內微球組小鼠與模型對照組小鼠血糖相比具有顯著性差異（P<0.05）。結論 采用復乳溶劑揮發法成功制備了可以緩釋40d的艾塞那肽長效微球，且40d之內在糖尿病小鼠體內具有明顯的降血糖作用。關鍵詞：艾塞那肽；聚乳酸羥基乙酸嵌段共聚物；微球；血糖中圖文類號： 文獻標識碼： 文章編號：Preparation of Long-acting Release Microspheres of Exenatide and Studies on Their in vivo Pharmacodynamics

3、LIU Bin1,2，DONG Qing-Guang1，WANG Meng-Shu1，LI Chun1，KONG Wei1,2，CHEN Yan1*（1. College of Life Science, Jilin University, Changchun 130012, China； 2. State Key Laboratory of Supramolecular Structure & Materials, Jilin University, Changchun 130012.,China.）ABSTRACT: OBJECTIVE To prapere Exenatide l

4、oaded long-acting release microspheres, and to evaluate their physical and chemical characteristics、in vitro release behavior as well as in vivo pharmacodynamics. METHOD Exenatide loaded PLGA microspheres were prepared by double emulsion(W/O/W)method. The mean diameter、morphology、drug loading and en

5、capsulation efficiency were evaluated. The micro-BCA protein assay was used for the in vitro release behavior. The effect of reducing plasma glucose were evaluated on the diabetes mice. RESULTS The microspheres possessed smooth and round appearance as well as good dispersive quality. The drug loadin

6、g and encapsulation efficiency was 3% and 75%. The in vitro accumulated release within 40d reached up to 88%, and the release profile is consistent with zero-class release model. The results of in vivo pharmacodynamics indicated that the plasma glucose of mice injected with Exenatide microspheres wa

7、s different significantly from the plasma glucose of the diabetes model mice within 40d (P<0.05). CONCLUSION The Exenatide loaded long-acting release microspheres which could yield 40d continuous release were prepared successfully by double emulsion method. The microspheres displayed significant

8、appearance of decreasing plasma glucose in the diabetes mice within 40d.KEY WORDS: Exenatide；poly ( lactide-co-glycolic acid)；microspheres；plasma glucose艾塞那肽（Exenatide）是Exendin-4的人工合成物，Exendin-4是美國西南部的大毒蜥在進食時所分泌唾液中的一種含有39 個氨基酸的多肽，分子式C184H282N50O60S，分子量4186.571。Exendin-4是胰高血糖素樣肽1（GLP-1）類似物，與哺乳動物的GLP-

9、1氨基酸序列具有53%同源性2，是有效的GLP-1受體激動劑，具有葡萄糖依賴型控制血糖濃度、刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胰島B細胞凋亡、減緩胃排空、減小食欲等生理活性35 ，適于2 型糖尿病的治療。Exendin-4的這些生理活性與GLP-1相似6，但GLP-1在體內迅速的被二肽基肽酶IV（DPPIV）所降解，半衰期只有1-2分鐘，會很快被清除7，而Exendin-4不易被DPPIV降解，對DPPIV的清除具有一定的抵抗作用，在體內循環的半衰期較長，可以達到60-90分鐘8。目前，艾塞那肽用于治療2 型糖尿病的研究已經越來越多，且其新藥上市申請(NDA)已于2005年4月獲美國FD

10、A批準，用于改善使用二甲雙胍和磺酰脲類藥物不理想的2 型糖尿病患者的血糖控制。臨床結果顯示，艾塞那肽用于糖尿病治療效果明顯9，且副反應較小，但是每天兩次的皮下給藥給病人帶來很多不便，其緩釋制劑則可以明顯的提高病人的順應性。本研究以可生物降解的聚合物PLGA為囊材，通過復乳溶劑揮發法成功制備了艾塞那肽PLGA長效緩釋微球，并觀察了其體外釋放及體內降血糖作用。1 材料、儀器與動物 1.1 儀器MICCRA D-8高剪切力勻漿器（德國ART公司）；5810R冷凍型臺式高速離心機（德國eppendorf公司）；XL30 ESEM FEG掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；Nano-ZS zetasize

11、r動態光散射儀（英國Malvern公司）；冷凍干燥機；ELX 800酶標分析儀(美國biorad公司)；三諾快速血糖測試儀。1.2 試劑艾塞那肽（長春百科生物科技有限公司提供,純度99以上）；PLGA（乳酸/乙醇酸比率即L /G比為50 /50,固有黏度為0.37 dL·g- 1 ,Mw 38600）購于美國伯明翰公司；聚乙烯醇( PVA, Mw3萬7萬, Sigma公司)；疊氮鈉購于Sigma公司；microBCA蛋白檢測試劑盒購于pierce公司；鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購于Sigma公司；二氯甲烷、SDS、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉等其他試劑均為分析純。1

12、.3 動物 昆明小鼠，體重均在1820g，雌雄各半，購于吉林大學基礎醫學院動物實驗中心。2 實驗方法2.1 艾塞那肽PLGA微球的制備 參考文獻報道10，采用復乳溶劑揮發法（W/O/W）制備艾塞那肽PLGA微球，制備工藝如下：稱取一定量的艾塞那肽凍干粉，用醋酸鈉溶液溶解作為內水相，與一定濃度PLGA的二氯甲烷溶液混合，用高速勻漿器攪拌制得初乳，快速滴加到1PVA水溶液中，勻漿器高速攪拌得到復乳，繼續攪拌4h，離心收集微球，蒸餾水洗滌三次，冷凍干燥24h，即得。2.2 微球表征2.2.1 微球的形態、粒徑大小和分布取艾塞那肽微球凍干粉適量, 均勻涂在雙面膠帶上,離子鍍膜儀濺金，在XL30 ESE

13、M FEG電子掃描顯微鏡下觀察微球的表面形貌。取微球混懸液適量，用蒸餾水稀釋，用Nano-ZS zetasizer動態光散射儀測定粒徑大小和分布。2.2.2 微球載藥量和包封率的測定 采用文獻中報道的NaOH-SDS法來測定微球的載藥量和包封率10，具體操作如下：準確稱量10mg微球，用1ml 0.1mol·L-1 NaOH（含5SDS）溶液混懸，在100rpm、37水浴搖床中震蕩24h，8000rpm離心10min，取上清液，用microBCA試劑盒測定上清液中的艾塞那肽含量。 載藥量% =微球中所含藥物重量×100%微球的總重量微球的包封率% =微球的實際載藥量

14、5;100%微球的理論載藥量2.3 微球的體外釋放試驗準確稱量艾塞那肽微球20mg，混懸于10 mmol·L-1 pH 7.4磷酸鹽緩沖液(含0.01%疊氮鈉和5mmol·L-1 SDS), 置于玻璃離心管中，在水浴搖床中震蕩,速度100rpm，溫度37，每隔1d取出離心管于4000rpm離心10min,取出全部上清液, 用microBCA試劑盒測定上清液中艾塞那肽的含量。剩余微球加入全新的釋放液繼續在水浴搖床中震蕩。2.4 糖尿病模型小鼠體內的藥效學研究 2.4.1 動物分組及給藥方法 將體重18-20g昆明小鼠隨機分成4組，每組8只，雌雄各半，A組為空白對照組，B組為模

15、型對照組，C組為艾塞那肽水溶液實驗組，D組為艾塞那肽微球實驗組。A組、B組每天頸背部皮下注射生理鹽水2次，早晚各一次；C組每天頸背部皮下注射艾塞那肽水溶液2次，每天3g·Kg1，早晚各一次；D組頸背部一次性皮下注射艾塞那肽微球5mg·Kg1，注射前微球先用混懸劑（3羧甲基纖維素鈉0.1Tween20）混懸。B組、C、D從實驗開始的第1天每天腹腔注射STZ 30mg/kg（0.1mol·L-1檸檬酸緩沖液配置，pH5.0），連續7天，注射STZ前小鼠禁食12h。2.4.2 血糖測定 實驗開始的第0、4、8、12、18、24、30、36、40天早上在注射艾塞那肽水溶液

16、之前測定小鼠血糖，測量之前小鼠禁食12h，尾靜脈取血，用三諾血糖儀進行血糖測定，觀察小鼠40d之內的血糖變化情況。在實驗開始后的第20d，測定小鼠在早上給藥后的16h內的血糖，每隔1h測定一次，給藥前小鼠禁食12h，觀察各組在給藥后6h內的血糖變化情況。3 結果3.1 微球的理化性質 用復乳溶劑揮發法制備的艾塞那肽微球形態圓整，表面光滑，粒徑分布均勻，掃描電鏡照片見圖1，微球的粒徑分布見圖2。微球載藥量為3，包封率為75。 圖1 艾塞那肽微球掃描電鏡圖Fig 1 SEM photographs of Exenatide loaded microspheres 圖2 DLS測定的艾塞那肽微球粒徑

17、分布Fig 2 The particle size distribution of Exenatide loaded microspheres determined by DLS.3.2 微球的體外釋放 圖3是艾塞那肽微球的體外釋放曲線。微球在1d的突釋為18，第225d釋藥稍緩慢，2540d釋藥稍快，40d累積釋放達88。用線性回歸的方法進行微球體外釋放模型的擬合，結果顯示其釋放符合零級釋放方程。圖3 微球的體外累積釋放Fig 3 In vitro release of Exennatide loaded microspheres3.3 艾塞那肽微球在糖尿病模型小鼠體內的降血糖作用 各組小鼠

18、40d內的血糖變化見圖4。A組（空白對照）小鼠在40d內的血糖沒有明顯的變化；B組(模型對照)小鼠在注射STZ后血糖呈現明顯的上升趨勢，8d之后血糖穩定在 15mmol·L-1以上；C組(艾塞那肽水溶液)小鼠前8d的血糖呈逐漸上升趨勢，8d之后血糖在 10mmol·L-1上下波動，且明顯低于B組；D組(艾塞那肽微球)小鼠血糖變化趨勢與C組基本相同，且與B組在40d之內具有顯著性差異（P<0.05）。D組小鼠血糖在第40d明顯上升，與B組已沒有顯著性差異；而C組小鼠的血糖第40d變化不大。圖4 艾塞那肽微球注射后40d內小鼠的血糖變化 與模型對照組小鼠 *P<0.

19、05, *P<0.01（n8）Fig 4 Changes of Plasma glucose level in mice after the injection of Exenatide loaded microspheres *P<0.05, *P<0.01 VS diabetes model control（n8）3.4 給藥后6h內的血糖變化 為了觀察艾塞那肽水溶液組小鼠給藥后的血糖變化情況以及同一時間內微球組小鼠的血糖變化趨勢，實驗開始后第20d早上測定了給藥后6h內的血糖變化，結果見圖5。0時為給藥之前測定的各組小鼠的空腹血糖（小鼠已禁食12h），此時C組和D組的血

20、糖濃度相近。在A、B組注射注射用水、C組注射艾塞那肽水溶液后1h，C組小鼠血糖顯著降低，而D組小鼠血糖降低幅度較小，兩組小鼠之間的血糖差異隨著時間逐漸減小，6h時又達到同一水平。圖5 第20d給藥后6h內各組小鼠的血糖變化Fig 5 Changes of Plasma glucose level in mice of each group within 6h after the drug injection at the 20th day.4 討論目前，艾塞那肽的上市產品為1 日2 次的注射劑，而其緩釋制劑還沒有產品上市。Lilly、Amylin 和Alkermes 3 家公司共同開發的exe

21、natide (Byetta) 的1周1次使用的長效緩釋制劑用2 型糖尿病病人可安全有效地控制血糖，現正處于臨床階段。另外，Amylin公司研發的緩釋時間更長的艾塞那肽長效緩釋微球進行了大鼠在體實驗，28d之內可以增強血糖控制11。 本研究采用復乳法成功的制備了可以緩釋40d的艾塞那肽PLGA長效緩釋微球。復乳法是目前制備多肽微球最常用的方法之一，具有工藝穩定、設備簡單等特點。微球在體外能夠穩定釋藥40d，第1d突釋18，40d之內前期釋放較緩慢，后期釋放稍快，這是由PLGA微球的釋放機制決定的。通常，藥物從微球中釋放是一個三相過程：突釋相、擴散相和溶蝕相。突釋相是由于微球表面和近表面的藥物迅

22、速擴散到釋放介質中而出現的；擴散相是水性介質從微球表面的孔洞進入微球內部，導致藥物擴散釋放；溶蝕相是聚合物骨架降解導致藥物釋放。本實驗所制備的艾塞那肽微球表面光滑，表面沒有孔洞，所以在前期擴散相階段釋放較慢。本實驗采用腹腔注射STZ建立糖尿病模型，進行了小鼠體內的藥效學研究。實驗分別對比了空白對照組、糖尿病模型對照組、艾塞那肽水溶液組和艾塞那肽微球組小鼠40d內的血糖變化，結果顯示，正常小鼠在40d內的空腹血糖一直維持在正常水平，一次性注射艾塞那肽微球的小鼠40d之內與每天兩次皮下注射艾塞那肽水溶液的小鼠血糖變化基本一致，并與模型對照組具有顯著性差異，說明艾塞那肽微球在小鼠體內可以穩定緩慢的釋

23、放艾塞那肽，40d之內具有明顯的降血糖作用，且降血糖效果與每天兩次皮下注射艾塞那肽水溶液基本一致。第20d早上給藥后的6h的血糖測定結果顯示，艾塞那肽水溶液組小鼠皮下給藥后1h降糖效果最為顯著，這與文獻一致12，此時血糖明顯低于艾塞那肽微球組小鼠，而后兩組小鼠的血糖差異逐漸減小，6h與艾塞那肽微球組小鼠血糖相近；艾塞那肽微球組小鼠在6h內血糖變化較為平緩，沒有大的波動，說明艾塞那肽從微球中緩慢釋放，小鼠體內保持穩定的的艾塞那肽濃度。 體內外的結果顯示，所制備的的艾塞那肽微球在40d之內的緩釋作用明顯。參考文獻1. Eng J, Kleinman WA, Singh L et al. Isola

24、tion and characterization of exendin-4, an exendin-3 analogue, from Heloderma suspectum venomJ. J Biol Chem, 1992, 267: 7402-7405.2. Drucker DJ. Glucagon-like peptidesJ. Diabetes ,1998,47: 159 169.3. Nielsen LL, Young AA, Parkes DG. Pharmacology of exenatide (synthetic exendin-4): a potential therap

25、eutic for improved glycemic control of type 2 diabetesJ. Regul Pept, 2004,117: 77-88.4. Kolterman OG, Buse JB, Fineman MS, et al. Synthetic exendin-4 (exenatide) significantly reduces postprandial and fasting plasma glucose in subjects with type 2 diabetesJ. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88: 3082-3

26、089.5. Danny Soon, Prajakti A, Kothare, Helle Linnebjerg. Effect of Exenatide on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin in Healthy Asian MenJ. J Clin Pharmacol, 2006, 46: 1179-1187.6. MA Nauck. Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and incretin mimetics for the treatment of diabetesJ. Pract

27、ical Diabetes Int, 2005, 22(5): 171179.7. Gribble FM, Williams L, Simpson AK, Reimann F. A novel glucose sensing mechanism contributing to glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell lineJ. Diabetes , 2003, 52: 1147-1154. 8. Kolterman OG, Kim DD, Shen L, et al. Pharmacokinetics, pharmacodynami- cs, and safety of exenatide in patients with type 2 diab