1、去甲變腎上腺素ELISA試劑盒(德國(guó)IBL：RE59171)前言說(shuō)明兒茶酚胺類(lèi)腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺都是在腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和腦中合成的。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。因?yàn)閮翰璺影奉?lèi)物質(zhì)以及它們的代謝產(chǎn)物變腎上腺素和去甲變腎上腺素在許多疾病中的分泌都會(huì)增加，因此對(duì)它們進(jìn)行檢測(cè)可用于這些疾病的診斷。在這一實(shí)驗(yàn)中，診斷和神經(jīng)系統(tǒng)的續(xù)發(fā)性腫瘤都具有特殊的重要性。這一技術(shù)主要用于嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的診斷檢測(cè)。10%的嗜鉻細(xì)胞瘤表現(xiàn)為惡性增長(zhǎng)。而在良性腫瘤中可發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)及它們的代謝產(chǎn)物變腎上腺素和去甲變腎上腺素都會(huì)增加。

2、1、應(yīng)用范圍此酶免試劑盒可用于人體尿液中去甲變腎上腺素的體外定量檢測(cè),可手動(dòng)操作也可自動(dòng)操作.2、實(shí)驗(yàn)原理此ELISA試劑盒利用的是競(jìng)爭(zhēng)法原理，生物素標(biāo)記抗原和未用生物素標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合到抗體上生物素標(biāo)記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，未結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗原用洗滌液洗去。以抗生物素堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，以PNPP(對(duì)硝基苯酚磷酸鹽)作為底物液來(lái)檢測(cè)結(jié)合到抗體上的生物素抗原的量。將未知物的酶反應(yīng)活性和已知標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線相比較，可以得到未知物的量。3、 意事項(xiàng)和預(yù)防措施 1) 此試劑盒僅用于體外診斷和專(zhuān)業(yè)人士使用。2) 在檢測(cè)開(kāi)始之前，仔細(xì)和

3、完整的閱讀說(shuō)明書(shū)，使用試劑盒提供的包裝插件的有效版本， 確保所有的程序都清楚。尋求更多信息（比如：臨床背景，檢測(cè)操作，自動(dòng)化操作說(shuō)明，可選擇的軟件，文獻(xiàn)等等），請(qǐng)查看IBL公司主頁(yè)。3) 如果試劑盒有破壞的請(qǐng)與IBL公司聯(lián)系或是提交你的申請(qǐng)，但自您拿到試劑盒后最遲不超過(guò)一個(gè)星期。檢測(cè)時(shí)請(qǐng)不要使用已被損害的試劑，以確保自身安全。4) 按照批號(hào)和有效期，不混合使用不同批號(hào)的試劑，也不要使用過(guò)期的試劑。5) 遵守好的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則和安全指南。穿實(shí)驗(yàn)服，帶橡皮手套，有必要時(shí)請(qǐng)戴護(hù)目鏡。6) 此試劑盒中含有會(huì)傷害眼睛和皮膚的有害試劑。請(qǐng)閱讀材料來(lái)源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)單能夠從IBL公司主頁(yè)上

4、下載，也可直接咨詢(xún)IBL公司獲取。7) 根據(jù)國(guó)家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過(guò)的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進(jìn)行處理。8) 不要接觸終止液，以免造成皮膚損傷或著燒。4、 存與穩(wěn)定性試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8，避免熱源或太陽(yáng)直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。開(kāi)封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8的環(huán)境下。5、 樣品的采集與貯存注意人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會(huì)受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時(shí)內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類(lèi)藥物。

5、尿液可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內(nèi)的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。貯存-20避免熱源或太陽(yáng)直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。穩(wěn)定性6個(gè)月6、 試劑盒成分注意試劑盒有足夠做96份單孔檢測(cè)或48份雙孔檢測(cè)或間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素共同檢測(cè)時(shí)所需的試劑成分?jǐn)?shù)量標(biāo)記成分1×50mLASSAYBUF CONC檢測(cè)緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液，BSA（牛血清白蛋白），1%的NaN31×2.25mLACYLREAG酰化試劑，即用，內(nèi)含二甲基甲酰胺1×10mLINDICATIORBUF指示劑緩沖液，紫色

6、，即用，內(nèi)含Tris緩沖液和苯酚紅（pH小于7.5時(shí)顏色會(huì)發(fā)生變化）。2×50×HYDRTUB水解試管，可處理的聚苯乙烯試管1×20mLHClHCl，即用，內(nèi)含0.1M HCl1×12×8MTP包被板，可拆分，包被有抗兔IgG（羊，多克隆）1×7×0.35mLCAL A-G標(biāo)準(zhǔn)品，A-G含去甲變腎上腺素和0.1M的HCl0; 77; 192; 480; 1200; 3000; 7500mol/L0; 0.42; 1.05; 2.63; 6.56; 16.4; 41.0mol/L1×2×0.5mLCONTR

7、OL 1+2質(zhì)控1+2，即用，濃度及允許范圍請(qǐng)見(jiàn)標(biāo)簽3×BIOTIN LYO去甲變腎上腺素生物素(凍干品)，內(nèi)含去變甲狀腺生物素, Tris緩沖液,<0.1%NaN3(可再生)1×7m LANTISERUM去甲變腎上腺素抗血清，內(nèi)含含抗血清(兔),磷酸緩沖液,0.1%NaN31×250lENZCONJ CONC酶聯(lián)物(100×)，含抗生物素抗體,并聯(lián)結(jié)到堿性磷酸酶上,Tris緩沖液,0.01%NaN39×PNPP SUBSPNPP底物片，含PNPP1×27mLPNPP BUFPNPP底物緩沖液，含二乙醇胺、水和0.05%NaN3

8、1×15mLPNPP STOPPNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。1×50mLWASHBUF CONC洗滌液(10×)，含Tris緩沖液,HCL,吐溫,0.2%NaN33×FOIL粘性金屬板7、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）1) 移液器，體積：10;50;100;1000ul2) 玻璃試管（12×75mm）3) 振蕩器（200-900rpm）4) 旋渦混合器5) 水浴箱，906) 帶試劑儲(chǔ)器的8孔移液器7) 洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)包被板洗滌系統(tǒng)。8) 可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長(zhǎng)：600-650nm）9) 雙

9、蒸水或去離子水10) 吸水紙，取樣吸頭和計(jì)時(shí)器8、注意事項(xiàng)1) 樣品的不合理處理及實(shí)驗(yàn)操作的任何改動(dòng)都將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取樣體積、溫育時(shí)間、欲處理步驟都必須嚴(yán)格按說(shuō)明進(jìn)行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)移液器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。2) 一旦實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，所有的步驟都必須完整的進(jìn)行下去，切勿中斷。確保所有試劑、材料和設(shè)備都已準(zhǔn)備好。把所有試劑和樣品都平衡至18-25，在使用前，輕輕搖動(dòng)液體試劑和樣品，試劑混合過(guò)程時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡。3) 請(qǐng)勿接觸試劑、移液器、微孔/試管。加試劑和樣本時(shí)，請(qǐng)使用新的吸頭，以避免交叉污染。不用的試劑應(yīng)用蓋子蓋好，以免重復(fù)使用。4) 我們建議對(duì)樣品進(jìn)行雙份檢測(cè)，以便能糾正潛在的滴定錯(cuò)誤5) 用定標(biāo)儀對(duì)反

10、應(yīng)板進(jìn)行校準(zhǔn)。6) 溫育時(shí)間會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微孔加樣的順序和時(shí)間都必須一致。建議使用8孔移液器加樣。7) 包被板的清洗很重要，清洗不合理將會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議使用多孔移液器或自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)進(jìn)行清洗。溫育期間避免微孔干燥，清洗和吸液時(shí)不要碰到包被板微孔。清洗時(shí)，確保所有的微孔都充滿蒸餾水，并且無(wú)殘留物。8) 濕度會(huì)對(duì)包被孔產(chǎn)生影響，所以包被板未平衡到室溫時(shí)不要打開(kāi)包裝。不使用的微孔應(yīng)立即裝入含干燥劑的包裝袋中。9、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說(shuō)明手動(dòng)或自動(dòng)操作參考說(shuō)明注意這種96人份的試劑盒可分成3份獨(dú)立進(jìn)行，以下體積為4條（32人份）一次檢測(cè)所需體積。如果想把標(biāo)準(zhǔn)品從7份減到6份，可以把標(biāo)準(zhǔn)品G棄取

11、。而允許范圍相應(yīng)的減少到3000g/l。如果檢測(cè)是用了很多板條，則體積應(yīng)相應(yīng)改變。9.1凍干成分或濃縮成分的準(zhǔn)備特別注意如果你使用甲狀腺ELISA試劑盒來(lái)同時(shí)檢測(cè)間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素，請(qǐng)勿混合間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素酶聯(lián)物。稀釋/溶解成分稀釋比例備注貯存穩(wěn)定性15mL檢測(cè)用緩沖液150mL雙蒸水1:102-8°C2周15mL洗滌液150mL雙蒸水1:102-8°C4周1瓶去甲變腎上腺素生物素2mL稀釋的檢測(cè)緩沖液臨時(shí)配制,僅使用一次,靜置5min,混合時(shí)避免氣泡.-20°C2個(gè)月60l酶聯(lián)物6mL稀釋的檢測(cè)緩沖液1:101臨時(shí)配制,僅使用一次18-25

12、°C5小時(shí)3PNPP底物片8mLPNPP底物緩沖液臨時(shí)配制,僅使用一次18-25°C5小時(shí)9.2總?cè)ゼ鬃兡I上腺素檢測(cè)用的尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的水解（在水解試管中）注意水解這一步驟在總?cè)ゼ鬃兡I上腺素和總間甲腎上腺素的檢測(cè)中是必備的。而在游離去甲變腎上腺素和變腎上腺素的檢測(cè)中則無(wú)須水解。樣品被懷疑高于最高標(biāo)準(zhǔn)的樣品必須在水解步驟前用0.1M HCL進(jìn)行稀釋。9.2.1水解試管中樣品的準(zhǔn)備1) 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液樣品各10L加入到相應(yīng)的水解試管中2) 在每一試管中加入40L0.1M的HCl。3) 蓋好試管，90°C下水解1h（用溫度計(jì)測(cè)溫度）。之后平衡至室溫，旋

13、渦混合。4) 在每一試管中加入100L指示劑緩沖液，旋渦混合。5) 在每一試管中加入20L的酰化作用試劑，加入指示劑后立即震蕩，確保加入的酰化試劑和試管內(nèi)物質(zhì)完全混合。6) 蓋好試管，室溫下溫育15min。7) 在每一試管中加入1mL稀釋的檢測(cè)緩沖液。10、實(shí)驗(yàn)步驟手動(dòng)和自動(dòng)操作1) 將酰化標(biāo)準(zhǔn)品、酰化質(zhì)控品和酰化病人樣品分別50L加入到相應(yīng)的微孔中。2) 在每一微孔中加入50L去甲變腎上腺素生物素。3) 在每一微孔中加入50L去甲變腎上腺素抗血清。4) 蓋板，小心振蕩包被板。振蕩器（500rpm）上室溫溫育1h（500rpm）5) 移去粘性金屬板。棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250L洗滌液洗板6次

14、（洗板機(jī)洗）,(人工清洗則洗3次即可)，吸水紙上拍干。6) 在每一微孔中加入150L臨時(shí)配制的酶聯(lián)物。7) 蓋上一新的粘性金屬板。振蕩器（500rpm）上室溫（18-25）溫育30min。8) 移去粘性金屬板。棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250L洗滌液洗板6次（洗板機(jī)洗）,(人工清洗則洗3次即可)，吸水紙上拍干。9) 如果有條件的話，使用8孔微量移液器加底物液和終止液時(shí)。確保底物液和終止液都是相同的時(shí)間間隔加入。使用自動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。10) 在每一微孔中加入100L臨時(shí)配制的PNPP底物液。11) 振蕩器（500rpm）上室溫（18-25）溫育20min。12) 在每一微孔中加入100

15、L PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以混合溶液。13) 加入終止液后60min之內(nèi)在405nm處測(cè)OD值（參考波長(zhǎng)：60 0-650nm）11、結(jié)果計(jì)算在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上或用自動(dòng)的方法，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸，濃度為X軸，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。用立體圖、4參數(shù)對(duì)數(shù)圖或?qū)?shù)-對(duì)數(shù)圖都可獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用標(biāo)準(zhǔn)品的每一單值進(jìn)行計(jì)算（樣品結(jié)果明顯異常的值必須刪除掉，應(yīng)使用更加合理的單值）。樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。一旦樣品稀釋了，就應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋因子。如果樣品所測(cè)得的濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備說(shuō)明所述對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)⒅匦聶z測(cè)。計(jì)算每一尿液樣品的24小時(shí)的排泄量：g/24h=g/L×L/24h轉(zhuǎn)換：1ng/mL=1mol/L去甲變腎上腺素(g/L)×5.46×10-3=mol/L12、期望值實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作判斷任何治療結(jié)果的唯一因素