1、結締組織核心蛋白聚糖基因在結腸癌組織中轉錄水平表達的研究 作者：宋操 海萍 高申 張桂珍【摘要】 目的:觀察Decorin mRNA在結腸癌組織中的表達，探討Decorin表達與結腸癌的關系。方法:臨床手術切除新鮮結腸癌組織石蠟切片，應用原為雜交技術檢測Decorin基因轉錄水平的表達。結果:結腸癌組織中與相對正常結腸組織中均可見Decorin mRNA表達，但兩者之間的表達未見統計學差異（P>0.05）。結論:探索Decorin轉錄水平表達與結腸癌發生發展的關系，只應建立在大樣本觀察基礎上進一步作深入的研究。 【關鍵詞】 核心蛋白聚糖（Decorin）;結腸癌;原位雜交為了探討

2、結締組織核心蛋白聚糖（Decorin）與大腸癌發生發展的關系，本研究選擇臨床手術切除的新鮮結、直腸癌組織標本，應用原位雜交與從基因轉錄水平研究了Decorin在大腸癌組織中的表達。1 材料與方法 1.1 臨床資料1 / 112003年3月8月間吉林大學中日聯誼醫院手術切除結直腸癌標本10例，其中男性6例，女性4例，年齡3764歲，平均年齡51.2歲。手術后病理組織類型為管狀腺癌8例，乳頭狀腺癌2例。分化程度中、高分化腺癌7例，低、未分化腺癌3例。按Duke's分期A級1例，B級7例，C級2例。手術切除遠離結直腸癌的相對正常大腸組織標本9例，迅速固定4%多聚甲醛24hr，石蠟包埋。1.2

3、 實驗方法 1.2.1 原位雜交方法原位雜交探針針對人Decorin靶基因的mRNA序列為:（1）5'-ATGGA AATCA GA-CAG TACCT GGCAC AGTGG-3'（2）5'-AAGTT GAGAC TGTTG GTGAA ATTGC AAGAG-3'（3）5'-CCTTC TAGAC TTCAG ACCAC AGACA ACCTG-3'。 雜交程序:石蠟包埋切片厚度4m，58烤片30min，常規脫蠟至水;3%H2 O2 滅活內源性過氧化物酶，室溫10min，DEPC水洗3次;切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37消化20

4、min;原位雜交PBS洗5min×3次，DEPC水洗滌1次;1%多聚甲醛.0.1M PBS，含有1.1000DEPC后固定，室溫10min，DEPC水洗3次;預雜交恒溫38，2hr;恒溫箱38雜交過夜。372×SSC洗滌5min×2次;370.5×SSC洗滌15min×1次，370.2×SSC洗滌15min×2次;滴加封閉液，3730min;滴加生物素化鼠抗地高辛抗體，3760min，PBS洗5min×4次;滴加SABC，3720min，PBS洗5min×3次。滴加生物素化過氧化物酶，3720min，PB

5、S洗5min×4次;DAB顯色20min，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明封片。 1.2.2 原位雜交結果判定標準參照Fromowitz方法1，Decorin蛋白表達以細胞核或細胞胞漿內有棕黃色顆粒為陽性。隨機觀察5個中倍鏡下視野，每個視野計數100個細胞，算出各個視野中陽性細胞數的平均百分比進行計分。0%5%計為0分，6%25%計為1分，26%50%計為2分，51%75%計為3分，大于75%計為4分;染色強度則以陽性細胞呈現的染色特征為標準進行計分:細胞未染色計為0分，染色呈淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分;然后根據兩者相加所得的總分進行結果判定。01分為陰性（-），

6、23分為弱陽性（+），45分為中度陽性（），67分為強陽性（）。 1.2.3 統計分析SAS8.0統計軟件進行Fisher精確概率計算及t檢驗。 2 結果 Decorin mRNA在結直腸癌中的表達，結直腸癌癌細胞及相對正常大腸腺細胞內均可見Decorin mRNA表達（圖略）。其中相對正常大腸腺細胞Decorin mR-NA表達陽性率為100%，以胞核表達為主，胞核表達陽性率為66.67%，胞漿表達陽性率為33.33%。而結直腸癌癌細胞Decorin mRNA表達陽性率為60%（6/10），且均為胞漿表達。結直腸癌及相對正常大腸腺細胞Decorin mRNA陽性信號染色強度均較弱。雖然Dec

7、orin mRNA在相對正常大腸中表達陽性率高于結直腸癌，但其差別無顯著性（P>0.05）。見表1。 表1 Decorin mRNA在結直腸癌及相對正常大腸中的表達 組 織 n 總陽性（%） 陽 性 分 型胞核（%）胞漿（%）相對正常大腸 9 9（100） 6（66.67）3（33.33）結直腸癌 10 6（60） 0（0） 6（60）P值 >0.05 3 討論本實驗結直腸癌兩種腫瘤組織中Decorin表達的研究證實，Decorin在不同腫瘤組織中的表達是多樣的、復雜的。實驗結果在結直腸癌癌細胞及相對正常大腸均可見Decorin mRNA表達，在相對正常大腸中Dec

8、orin mRNA表達陽性率高于結直腸癌，但其差異無顯著性（P>0.05）;本實驗在對結直腸癌組織中Decorin表達的研究中雖然發現結直腸癌癌細胞中有Decorin mRNA表達，但未見Decorin蛋白表達。Decor-in在腫瘤組織及腫瘤細胞中的多樣化表達表明其在腫瘤發生、發展中的作用是復雜的。早期研究認為Decorin表達增加，利于腫瘤發生、發展，認為Decorin的合成受到腫瘤細胞調控，腫瘤細胞通過控制自身微環境變化，進而展現浸潤性生長及轉移特性。近年來研究普遍傾向于認為Decorin可抑制腫瘤生長，Decor-in表達減少，利于腫瘤發生、浸潤、轉移。 本研究同時也作了

9、Decorin免疫組化，但未發現有蛋白的表達，也就是說Decorin mRNA表達水平與其蛋白表達不完全一致。國外一些研究也同樣發現在某些組織中雖然有Decorin mRNA表達，但相應Decorin蛋白表達卻很少或缺如。Leygue E等2在研究Decorin在乳腺癌中的表達時發現用免疫組化與Western blot方法檢測Decorin蛋白表達，不如用原位雜交方法檢測Decorin mRNA表達顯著。相關研究顯示SLRPs家族中其他成員同樣存在mRNA與蛋白表達的差異。在正常的腱組織中可見aggrecan和versi-can的mRNA和蛋白表達水平不一致2。Decorin和iglycan在

10、正常和反應性胃粘膜中mRNA與蛋白質定位不同3。在血管周圍的軟骨基質及長骨的生發區同樣可見Decorin和biglycan的mRNA與蛋白質的定位不同4。 組織中Decorin mRNA與蛋白表達水平不一致，其原因可能是組織中Decorin mRNA表達和蛋白表達本身是不盡相同的。組織中可能存在Decorin mRNA轉錄但蛋白質翻譯減少或缺如。其次，這種蛋白質和mRNA表達水平不同，可能是因為蛋白質合成和分解速度不同。研究發現上皮細胞在生長因子如bFGF刺激下，biglycan不僅轉錄、蛋白質合成增加，其相應蛋白水解率也增加。蛋白質翻譯減少或降解增多均可導致組織中Decorin蛋白表達減收或

11、缺如;最后，可能是因為天然蛋白形成中的自然折疊或者翻譯后修飾變化，或者是與組織中其它蛋白結合，導致Decorin抗原表位被遮蓋，故檢測不到Decorin蛋白表達58。本研究在結直腸癌癌細胞及相對正常大腸組織均見Decorin mRNA表達，但兩者之間的表達差異不明顯，仍需擴大樣本量系統深入研究，有利于發現規律性的變化。【參考文獻】 1Fromowitz FB，Viola MV，chao S，et al.Res p21expression in the progression of breast cancerJ.Humpathol，1987，18:1268-1275.2Leygue E，Snel

12、l L，Dotzlaw H，et al.Expression of lumican in human breast carcinomaJ.Cancer Res，1998，58（7）:1348-52.3Waggett AD，Ralphs JR，Kwan AP，et al.Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human Achilles tendonJ.Matrix Biol，1998，16（8）:457-70.4Schonherr E，Lugering N，Stoll R，et al.Di

13、fferences in Decorin and biglycan expression in patients with gastric ulcer healing. Scand J Gastrocnterol，1997，32（8）:785-90.5Bianco P，Fisher LW，Young MF，et al.Expression and local-ization of the two small proteoglycans biglycan and Decorin in de-veloping human skeletal and non-skeletal tissuesJ.J Histo-chem Cytochem，1990，38（11）:1549-63