1、 目的基因第1頁/共46頁C下列不是基因載體必須具備的條件的是下列不是基因載體必須具備的條件的是 ( )( ) A A、能自我復制、能自我復制 B B、有多個限制酶切點、有多個限制酶切點 C C、具有標記基因、具有標記基因 D D、它是環狀、它是環狀DNADNAD第2頁/共46頁第3頁/共46頁真核生物的基因結構編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚合酶結合位點前體信使RNA成熟的信使RNA第4頁/共46頁第二節基因工程的基本操作程序第5頁/共46頁（一）獲得目的基因（二）構建基因表達載體形成重組DNA分子（三）將目的基因導入受體細胞（四）目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序第6頁/共46頁用

2、用DNADNA合成儀人工合成合成儀人工合成利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增已知序列：已知序列：從基因文庫獲得從基因文庫獲得未知序列：未知序列：（一）目的基因的獲?。耗康幕蚣次覀兯枰?基因?；蚪M文庫：含某種生基因組文庫：含某種生物的全部基因物的全部基因部分基因文庫：含某種部分基因文庫：含某種生物的部分基因生物的部分基因（如（如cDNAcDNA文庫）文庫）第7頁/共46頁cDNA文庫基因組文庫從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因第8頁/共46頁鳥槍法：散彈射擊法供體細胞DNA限限制制酶酶許多DNA片段載入載體導入受體細菌擴增產生特定性狀分離目的基因構建基因組文庫并獲得目的基

3、因：第9頁/共46頁 基因組DNADNA文庫的構建 將總DNADNA經過酶解，分離不同長短的DNADNA片段。包含的基因組片段分別克隆在質?；蚴删w載體上，轉染細菌或體外包裝到噬菌體顆粒上便構成了該生物的基因組文庫。第10頁/共46頁目的基因的mRNA逆轉錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）逆轉錄法構建cDNA文庫并獲得目的基因載入載體導入受體細菌擴增產生特定性狀分離目的基因第11頁/共46頁第12頁/共46頁第13頁/共46頁蛋白質氨基酸序列推測mRNA的核苷酸序列推測結構基因的核苷酸序列（單鏈）根據已知氨基酸序列直接合成DNA化學合成人工合成核苷酸序列已知，把將要合成的DNA序列輸入到D

4、NA合成儀，用化學方法直接人工合成第14頁/共46頁聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應PCRPCR是由美國科學家是由美國科學家第15頁/共46頁 PCR的反應體系的反應體系 模板：模板：DNA 原料：原料：四種四種 脫氧核苷酸；脫氧核苷酸； 酶：酶：Taq酶（酶（ TaqDNA聚合酶）聚合酶）嗜熱細菌中分離得到嗜熱細菌中分離得到 引物：引物：DNA片段片段 MgMg2+2+（維持酶活性所必需）（維持酶活性所必需） PCRPCR緩沖液：緩沖液：維持PH恒定，保護Taq酶 第16頁/共46頁1變性 雙鏈模板DNA解離為單鏈結構。（9095）DNA雙鏈DNA單鏈變性第17頁/共46頁2退火 引物與模板互補

5、成雙鏈。 （5560） (由于引物濃度高，序列短，所以易與模板結合。)引物第18頁/共46頁3延伸 在Taq酶作用下，合成特異DNA序列。7075延伸第19頁/共46頁變性變性第二次循環第20頁/共46頁退火退火第二次循環第21頁/共46頁延伸延伸第二次循環第22頁/共46頁 PCRPCR反應曲線反應曲線 理論上，理論上，PCRPCR反應產物呈指數增長，但這種增長形式在擴增反應產物呈指數增長，但這種增長形式在擴增25-3025-30個循環以后便放慢直至停止，達到反應平臺。此時擴增個循環以后便放慢直至停止，達到反應平臺。此時擴增產物量不再隨循環次數的增加而呈指數增長。產物量不再隨循環次數的增加而

6、呈指數增長。第23頁/共46頁PCR儀程序設定第24頁/共46頁PCR的應用 PCRPCR具有省時、操作簡便、特異性強、靈敏度高、效率高、應用范圍廣等特點。具有省時、操作簡便、特異性強、靈敏度高、效率高、應用范圍廣等特點。PCRPCR技術在技術在分子生物學、醫分子生物學、醫學和案件偵破學和案件偵破等領域得到廣泛應用。等領域得到廣泛應用。第25頁/共46頁實例 1： 1、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈是（ ） A.從基因文庫中獲取目的基因 B.利用PCR技術擴增目的基因 C.反轉錄法 D.通過DNA合成儀利用化學方法人工合成第26頁/共46頁（二）基因表達載體的構建形成重組DNA分子切割目的

7、基因和質粒的限制酶是同一種限制酶嗎？同一種第27頁/共46頁目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并遺傳給下一代，使目的基因表達和發揮作用。第28頁/共46頁目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程，稱為定和表達的過程，稱為轉化轉化。常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、 土壤農桿菌、酵母菌、動植物細胞等土壤農桿菌、酵母菌、動植物細胞等 將目的基因導入受體細胞第29頁/共46頁主要借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。主要借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。導入方式：導入方式：（三）將重組DNA分子導入受體細

8、胞第30頁/共46頁導入微生物細胞將目的基因克隆到大腸將目的基因克隆到大腸桿菌細胞中的操作步驟：桿菌細胞中的操作步驟：1)1)獲得目的基因和質粒載體；獲得目的基因和質粒載體；2)2)形成重組質粒；形成重組質粒；3)3)制備制備感受態細胞感受態細胞，用重組質，用重組質粒轉化大腸桿菌細胞；粒轉化大腸桿菌細胞；4)4)培養大腸桿菌，讓重組質粒培養大腸桿菌，讓重組質粒形成大量拷貝；形成大量拷貝；5)5)篩選含重組質粒的大腸桿菌篩選含重組質粒的大腸桿菌細胞。細胞。第31頁/共46頁導入植物細胞：導入植物細胞：土壤農桿菌轉化法土壤農桿菌：具有趨化性（酚），感染雙子葉植物和裸子植物土壤農桿菌：具有趨化性（酚

9、），感染雙子葉植物和裸子植物第32頁/共46頁基 因 槍 法：單子葉植物常用的一種基因轉化方法，但成本較高?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ菏趾啽憬洕姆椒āＮ覈霓D基因抗蟲棉就是用此方法獲得。第33頁/共46頁 將目的基因導入動物細胞將目的基因導入動物細胞方法：顯微注射法方法：顯微注射法程序：程序： 重組DNA提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵發育 新性狀動物第34頁/共46頁轉基因動物第35頁/共46頁1.1.篩選含有目的基因的受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞通過檢測標記基因的有無，來判斷目的基因是否導入受體細胞。通過檢測標記基因的有無，來判斷目的基因是否導入受體細胞。（1）抗藥性篩選法：菌株為某種

10、抗生素缺陷型， 而質粒上帶有該抗性基因（如抗氨芐青霉素，抗卡拉霉素等）。如何篩選出含有目的基因的受體細胞？（這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養基上長出。）（四）目的基因的檢測與鑒定（四）目的基因的檢測與鑒定第36頁/共46頁pBR322質粒結構如果外源如果外源DNA插入，插入，氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因失抗性基因失活活標記基因標記基因進行篩選進行篩選限制性內切酶限制性內切酶識別序列識別序列外源基因連接外源基因連接PStPSt自主復制自主復制第37頁/共46頁（2 2） DNA分子雜交檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的基因首先取出轉基因生物的基因組DNA用含目的基因的DNA片

11、段（單鏈）用放射性同位素等作標記,以此做探針使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中過程:第38頁/共46頁利用DNA分子雜交篩選含有目的基因的細菌克隆檢測方法：DNA分子雜交技術第39頁/共46頁DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 第40頁/共46頁2.檢測目的基因的表達檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質目的基因成功表達的標志體現特定性狀檢測性狀第41頁/共46頁 （3 3）鑒定（個體生物學水平）：（1 1）檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA（2 2）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法: :分 子 雜 交方法: :抗原抗體雜交過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA第42頁/共46頁第43頁/共46頁回答問題：1、基因工程的別名：2、操作環境：3、