1、質譜定雖的原則系列講座（轉自分析測試白科叮當空間）質譜定量的原則01-目錄：1.質譜定量的簡介a）總離子流b）選擇離子監測（SIM）c）選擇反應監測（SRM/MRM ）2 .開發一個 SRM方法3. 內標4. PK/LC/MS/MS 藥物代謝動力學的LC/MS/MS的反相液相色譜的方法開發5 .樣品制備6.標準和標準曲線的準備a）做標準曲線的步驟b）標準曲線的稀釋方案Scheme的舉例c）標準曲線的運行d）進行標準品和樣品的隨機化e）系統運行的實用性f）“Q（®量控制7 .相關的PK資源8.定量的技巧Tips質譜定量的原則02質譜定量的簡介和LC/MS監測的模式簡介本教程主要用于：使

2、用質譜作小分子藥代動力學分析，即 PK/MSo除此之外, 這些同樣的原則也可用于生物基質中肽和蛋白的定量。傳統上，在使用現代質譜定量之前，定量是用HPLC高效液相色譜和UV紫外檢 測器實現的。HPLC藥代動力學分析建立在保留時間、峰面積和紫外光譜性質的 基礎上的。HPLC方法的缺點是靈敏度不夠、缺乏特異性。我們已經看到一些實 例，一個化合物的確已經代謝了，然而保留時間和紫外光譜上，母離子和代謝物 無法區分。這種缺少特異性的分析時不時會誤導研究者。 所以在藥代動力學分析 中，基丁質譜的表征現在是一種新型的重要的工具。質譜定量中已經被廣泛接受的方式是 MS/MS定量。這種定量常通過三級四極桿 或離

3、子阱質譜實現。要求使用 MS/MS的原因是：許多化合物有同樣的質量。當 使用第一個維度即單級質譜 MS去定量時，也會缺乏特異性，尤其是對丁像血液 那樣的復雜的基質。第二個維度的 MS （即MS/MS）在大多數情況下，能夠提 供唯一的斷裂。合并特異的母離子質量和唯一的碎片離子信息， 可以選擇性地監 測被定量的化合物。下面我們將討論獲得和可視化LC/MS數據的方法。獲得和可視化LC/MS的數據，或稱為：質譜數據如何在一個 LC/MS實驗中表 達？典型的方法，質譜被設置為掃描特定的質量范圍。 在全掃描分析中，質量掃描范 圍較寬；在選擇離子監測 SIM時，質量掃描范圍較窄。依賴丁掃描的類型，一 個獨立

4、的質量掃描時間可以從10 ms到5秒。在一次LC/MS分析中可獲得許多 個掃描。LC/MS數據的表示方法為：把每個質量掃描的離子流信息疊加，畫出 隨時間變化的總離子流，橫軸是時間，縱軸是強度。總離子流圖非常像HPLC的 紫外圖，見圖1。下面我們將討論各種掃描的模式，和這些模式同質譜定量的關系。最常見的LC/MS數據模式為：（1）總離子流圖（2）選擇離子監測（SIM）（3）選擇反應監測（SRM）或多反應監測（MRM ） : MRM和SRM本質上 是同樣的實驗模式。從藥代分析中得到的全質量范圍的總離子流圖（TIC）非常像HPLC UV圖，除 了 ：質譜能檢測到更多的化合物，尤其是沒有紫外吸收的化合

5、物。總離子流是一個疊加圖，疊加了每個質量掃描的離子流。當一個小分子或小肽流出HPLC色譜 柱時，相對強度上升，在 TIC圖上出現了一個峰，橫軸是時間。每個質量的化 合物都被記錄在TIC圖上。找出感興趣的化合物可能是困難的，因為許多化合 物有相同的質量。化合物的天然質量不是鑒定的唯一性數據。設置一個確定的質量，可以畫出一個提取離子流圖，但這個圖的強度會比下面介紹的SIM實驗中的強度低。（注意：TIC指的是在一段時間內采集的質量掃描數據， 不特指掃描范圍或質譜 實驗的類型。例如，我們可以在 SIM或SRM實驗中獲得TIC圖。然而，為簡單 起見，我們將把這些圖稱為 SIM和SRM圖，而不是SIM T

6、IC圖。）Selected Ion Monitoring 選擇離子監測在選擇離子監測中，質譜被設置為掃描一個非常小的質量范圍，典型的是一個質量數的寬度。選擇的質量寬度越窄，SIM的確定度越高。SIM圖就是從非常窄的 質量范圍中得到的離子流圖。只有被該質量范圍選擇的化合物才會被畫在SIM圖中。圖1和圖2是同一個樣品的譜圖，然而它們看起來很不相同。原因是在 SIM圖中，畫的是TIC圖中較少的組分。SIM圖是比TIC圖更確定的圖。Selected Ion Monitoring (SIM)然而，SIM圖仍顯示了許多峰，不能唯一地確認我們感興趣的化合物。 一個復雜 的樣品（比如血活或血漿）中，這樣的圖是

7、一個典型的 SIM圖。許多化合物有 同樣的質量，在ESI中還有多電荷峰也和我們感興趣的化合物有同樣的 m/z值。 SIM實驗比全掃描實驗更靈敏，因為質譜在一個更小的質量范圍上駐留（ dwell） 更長的時間。Selected Reaction Monitorin蕤擇反應監測（SRM）SRM被大多數科學家在質譜定量中使用，見圖 3。SRM中，可以監測一個特征 的唯一的碎片離子，在很多非常復雜的基質中進行定量。 SRM圖非常簡單，通 常只包含一個峰。這種特征性使 SRM圖成為靈敏度高且特異性強的理想的定量Selected Reaction Monitoting (SRM)SRM的過程：選擇一個特征

8、的母離子做 MS/MS ,在其碎片中選擇一個特征的子 離子作為監測離子。可以把 SRM理解為碎片離子的SIM。這種特征性的實驗被 成為“transition (躍遷)，可以表示為：母離子 t子離子，舉例：534 t 375質譜定量的原則 03建立 個SRM Transition 534 t 375一個定量分析方法應該是特征性的、高準確度和高靈敏度的。在不犧牲上述特性 的前提下，建立方法應該盡可能地快速，質譜定量可以很好地滿足這些規則。在建立一個感興趣的化合物的 MS/MS碎片transition的時候，一種優化transition 的方法是用注射泵進樣(syringe pump)該化合物來優化

9、。先在全掃描方式中優化母離子信號。因為 MS/MS的靈敏度將依賴丁化合物在全 掃描模式中是否響應得好，要盡可能地優化全掃描的、非 CID響應的MS信號然后優化碰撞能CE和碰撞氣體，給出豐度最高的碎片離子。不能使用太大的碰 撞能CE,因為太大的CE會丟失穩定的、有價值的碎片峰。我應如何優化碎片峰？”可以用注射泵進樣化合物，進行 MS/MS ,挑出一個穩定的碎片峰，當改變 碰撞能和碰撞氣體參數時監測它的離子流。最后當獲得最大的碎片離子峰響應時 確定碰撞能和碰撞氣體參數。現代的三重四極桿質譜都可以自動優化。MS/MS Framentiticin of 554從優化好的MS/MS譜中，選擇一個合適的碎

10、片峰用于定量監測。如圖 A所示， 母離子質量為534,似乎從圖B中可以很容易選擇一個碎片峰做 Transitiono 一 個基本考慮是盡可能不要選擇離母離子太近的質量。非常常見的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：534-517= 17。我們應盡可能不要選擇失水 峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因為這會導致一個不是很特異的 transition0 這里，Transition 534 375是一個好的選擇。另外要注意的是：要選擇一個穩 定的峰。當直接進樣化合物時，被選擇做 Transition的峰必須每次掃描響應都一 致。提示：當優化MS條件時，最好能模擬實際做樣的條件。例

11、如：實際做樣時色譜 流速是400 ul/min,化合物在30%有機相時流出，用注射泵進樣優化 MS條件時 最好模擬這個條件，即設置 HPLC流速為400 ul/min , 30%有機相；然后用三通 注入化合物。同時，第一次優化實驗時，我們可以選擇60/60的梯度，去表征化合物的疏水性， 從而得知它在C18反相柱上的色譜行為。如果你對所有的化合物都按這樣的方 法實驗，你就可以建立一個洗脫數據庫，可以作為將來實驗的參考。注：60/60梯度的意思是：梯度從近100%水相開始，在60分鐘內到達60% 有機相。質譜定量的原則04內標在做MS定量時應該使用內標。選擇一個合適的內標，將能減少因為樣品提取、

12、HPLC進樣和離子化的多樣性造成的差異。在復雜基質的分析中，在 SRM積分 圖上，在標準曲線的低端，常會見到：兩個不同的濃度水平，會給出近乎一致的 響應。只有當使用一種內標時，這兩個點才能被區分。一些研究者試圖在實驗中 不用內標去做標準曲線，但成功率不高。我們在標準曲線上每個濃度水平都重復 進樣3次。沒有內標的情況下，重現性 RSD常常會高于20%;而當使用內標 時，%RSD能降低到近2%。我要如何選擇一個內標？最好的內標是待定量的化合物的同位素內標。同位素標記的內標將和待測物有相 似的回收率、ESI離子化響應，和相似的色譜保留時間。如果你運行的不是臨床 藥代動力學定量，可能很難判斷上述說法，

13、因為特殊的合成一個同位素標記的內 標，是非常昂貴和耗時的。通常，如果你和一個醫學的化學家工作，他們會有一個化合物相似物庫，可以被 用作內標。這些類似物，在化合物合成中被測試，和該化合物性質相似可以被用 戶定量內標，而且更重要的是，這些類似物和該化合物的母離子質量有微小的差 異。盡量不要使用去甲基化（一14）或者是氧化的（+ 16）的類似物作內標，因為待 測化合物的母離子常會發生同樣的代謝。常見的做內標的類似物是氯代的化合物。氯代的化合物類似物會和待測化合物有 相似的色譜保留時間，這是內標的一個重要特性。我們已經發現內標物的一個最 重要的特性是它和待測化合物共流出。我該如何使用內標？首先，內標添

14、加需在樣品測試方法的開始階段，典型的，應在血漿crash或固相萃取之前。內標應用同一濃度水平添加（包括標樣）。內標應給出可靠的質譜響 應。應該注意的是：內標的量應添加得合適，應高丁定量限，但不能過高，因為 過高的內標響應會抑制被分析物的離子化。我應該添加多少量的內標？ ”這是一 個重要的問題。通過做一些試分析：早、中、晚的時間點，也許一個或兩個標準 點，你應該知道你的樣品中化合物的大概量。這些信息非常有價值，可以幫助建 立一個合適的標準曲線，并知道應添加多少量的內標。舉例來說：如果待定量的 樣品濃度范圍是100 fg25 pg,檢測限是100 fg,你應該添加510 pg的內 標。一個好的經驗

15、法則是：內標物的量大概是標準工作曲線濃度最高點的1/3。這將給出一個比較不錯的響應，并且不會抑制和干擾待測樣品的離子化。見圖 1圖1內標的量（內標.gif）質譜定量的原則05液相色譜申聯質譜聯用藥代動力學方法開發更快就是更好！在每一個藥代動力學分析中更快就是更好！樣品組/系列包括：重復的標準品，QC質控樣品，和樣品，加起來大概要進行 300次分析。如果每個樣品實驗耗時15分鐘，整套分析要75個小時。高要求的 實驗（加上質譜）總計要超過 3天時間。一些該領域的研究者可以只花 12分 鐘分析一個樣品；而大多數的PK/MS的實驗室一般很容易做到花34分鐘分析一個樣品。如果對上面同樣的300個樣，4分

16、鐘一個實驗的話，總分析時間可減 少到20個小時。所以，每分鐘都是很重要的！在 2m心3050mm反相短柱上 可以獲得快速的梯度和快速的平衡時間。LC/MS的非藥動實驗中，流速一般為 200 |/min.，而在LC/MS的藥動實驗中，流速一般設為 4001000 |/min 0更 快的流速有助于加速洗脫和平衡。下面是典型的LC/MS藥動實驗條件：LC/MS藥動實驗方法：色譜柱：2.1 X 50 mm, 5, 100 ? , C18柱溫：40 C流動相：A為水相（0.1%甲酸），B為乙睛（0.1%甲酸） 流速：400(J/min梯度：Time(min.)%B0252802.125425Notes：

17、a）調節初始的 B使其適應該化合物b）試著減少梯度時間到1分鐘以縮短方法時間優化梯度：當然你要對每個化合物特別的進行方法優化。我們推薦創建一個色譜數據庫，詳 細地記錄實驗室接手的各個化合物的疏水性（可以運行60/60方法完成）。當你需要挑選一個相似疏水性的內標時，這樣的色譜數據庫將非常有用。在長時間的 梯度中， B的起始值一旦明確，那么在縮短時間時，就把 B的值降10%。舉 例來說，如果 B初始值是40%，那么在運行液質藥動方法時，起始值 B就是 30%。這種方法將確保你的化合物可以留在你的柱子上。優化柱子和流動相：在上面舉例的液相條件中，一些化合物有可能響應得不好。一些化合物可能要求 不同的

18、有機改性試劑或有機相。一般，磷酸鹽不適用于質譜。有些人用1020mM 低濃度的醋酸鉉作A相緩沖鹽。另一些人合并甲醇和乙睛在 B相中。如果你的 化合物峰形不好，需要改變幾個或者所有的實驗參數。必須選用合適的柱子去獲 得好的回收和好的峰形。幫助提示：1）一個質譜實驗室可能要整日忙著做色譜方法開發，尤其是如果這個實驗室每 周要接510個新化合物樣品。在組合化合物和它們的內標，進行組合的色譜方 法開發方面我們頗有心得。并不是所有的化合物適用于這種方式，但是這個方法 為我們節省了大量的方法開發的時間。當我們發現做6個化合物混合樣的方法開 發時間，和一個化合物的幾乎一樣時，這個在新的組合給藥（casset

19、te dosing方 法開發中，該方法就變得非常有用。注：cassette dosing是一種新的給藥方法，稱為盒式給藥法，乂稱為組合給藥技 術，由Ber- man等提出，即給動物同時服用幾種藥物，按常規取樣時間取血， 運用HPLC聯用技術進行樣品處理分析。2）加速方法開發。許多常見化合物如布洛芬已經有人建立了方法，檢索一下文 獻、互聯網和USP的出版物，查到這些方法。不要浪費時間從頭開始 ！3）組合給藥技術常常加速化合物篩選過程。許多研究者不愿做組合實驗技術， 是因為害怕藥物-藥物相互作用。一種可取的方式是給藥后合并化合物。合并上 述的方法開發方法，可以為任務重的實驗室節省大量的時間。4）H

20、PLC自動進樣器往往是出奇的慢，記得在平衡時間里考慮自動進樣器，因為當自動進樣器工作時，柱子是在初始化（initial）條件下被活洗的，必須在平衡 時間里考慮這個時間。你可以從方法里砍掉3060秒的平衡時間。要分秒必爭嘛！從300個樣品分析中，每個砍掉3060秒，就是5個小時啊！ 質譜定量的原則06一樣品的制備（適用丁液質藥動分析的樣品制備）樣品一般在血漿或血活中。離心去除血液里的血細胞獲得血漿。血液凝固后 去除固體得到血活樣品。凝固血液活除血液細胞和凝血因子。血活比血漿易丁處 理，因為凝血因子已經被去除。當使用儲存的血漿時，常會發現蓬蓬的凝塊物， 使樣品很難進入吸液管pipette不管是血活

21、還是血漿，在進入反相柱分析前都要 作進一步的處理。下面會討論幾種的方法用以制備可以用作液質藥動分析的血漿 和血活樣品。血漿破碎（crash （有時稱蛋白沉降）血漿破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因為它一般不要求特殊的儀器。用乙 睛或甲醇沉淀去除豐度的白蛋白。一個典型的方法描述如下：前處理血漿蛋白沉淀.jpg （26.75 KB）血漿破碎（crasD /蛋白沉降方法：1）放50?l血漿或血活在0.5毫升管中2）加10?l內標3）添加140?l冷（凍）的有機溶劑（乙睛或甲醇）然后渦旋4）冷凍樣品2小時5）稍稍離心樣品，分離出沉淀的蛋白6）取150?l上活液至一干凈管，加150?l液相的A相（水相）.

22、在這時，樣品里含的有機相大概為 38%。如果你的化合物要求更低的有機 相，來保留在色譜柱上，應增加第 6）步添加的水相的量。7）把6）項的樣品，進行HPLC進樣做液質聯用的藥動分析。固相萃取：許多人首選固相萃取法 SPE。在SPE中，血漿或血活被直接加入一個疏水 的固相中，一般是 C18小柱。加入后，用有機相淋洗小柱，則感興趣的小分子 會被洗脫下來。SPE可以是手動的，也可以是小批量的。手動的SPE制備方法限制了樣品的通量。可以用96孔板做自動化。一些人認為96孔板非常貴，一個 96孔板大約為100美元，但是痕量成本時應該考慮易用性和最終產品的貢獻。 一些人發現：用丁液質聯用藥動分析的最終洗提

23、液（eluant）質量更好，反相柱的附著物和質譜信號的滾動（roll-off）發生在較低的速率。液液萃取：必須承認我們在這方面沒有很多經驗。這里是我所知道的。液液萃取只工作 在那些可以分隔進入有機相的化合物。它可能是一種樣品凈化的有效方法。然 后，這種技術很難自動化。藥代的各種樣品處理波液林（LLE）固相萃職（SPE）蛋白沉降（PPT11職部分樣品乙添加內標加入緩神袱加入甲基叔丁基醒振揮1盼鐘離心移走oue3-蓄發至干重溶1C轉移到進樣瓶1進樣1瑕部分樣品2. 添加內標3. 加隘酸4. 活化吸附劑加樣品到吸附劑中6. 神洗7. MS3,重溶9. 轉移到進祥瓶10. 進樣1. 職部分樣品2. 添

24、加內標3. 加入乙睛4 -離心5, 移走6, 重溶了，轉移到進樣瓶8.進祥這是一個補充的圖，一種列表的方式，介紹各種前處理。各課題組，都根據自己的需要選擇方式。夢想的方法是：簡單的沉淀、離心蛋白法。這時候可能有堵的問題，因為處理非 常簡單，也許會堵。所以各個用戶買液質的時候會問賣液質的銷售一個sillyquestion：你們的儀器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？問的可愛，答的精彩”！質譜定量的原則07質譜藥動定量分析的標準物和創建標準曲線簡介完整的定量分析依賴丁參考標準的質量。一種合格的參考標準，應能通過（pasS> 一系歹0定性參考標準的測試。參考標準的定性測試要設計為：充分地表

25、征參考標 準的質量和含量。如果參考標準的含量不對，那么建立在其上的定量分析一定是 錯的。然而，當進行 研究性藥動”時，可能沒有足夠的時間去充分地表征化合物， 因為很簡單，在一周內，實驗室要做三種新化合物。所以，當面臨開發一種研究型藥動”方法時，實驗室應努力建立一個假定的參考標準，在做整套化合物實 驗室保持不變，而且實驗室能夠永久地獲得該假定參考標準，用丁日后的參考。這個步驟能確保：每個相對丁這個假定的參考標準的藥動實驗能夠被測量。創建 標準曲線的步驟在定量分析中也至關重要。為了使分析可靠，這個參考標準必須可靠，在創建標準曲線上的每一點時，每一 次稱重和取液都必須準確無誤。下面我們介紹，在液質藥

26、動定量分析中典型的創 建標準曲線的方法。創建標準曲線匯集所有可能知道的關丁未知樣品濃度范圍的信息，可以有計劃地繪制標準曲 線。以前曾介紹過一個快速的估算方法，早、中、晚的時間點伴隨著低、中、高 濃度的標準。鬼峰將允許創建一個更適當的標準曲線范圍，并會告訴你應注入多少量的樣品。這些步驟可以使你免丁重復長時間的開發。 有些時間點可能包含高 濃度的目標化合物。這個初步的分析可以告訴你是否稀釋， 例如，最早的時間點 乘以10倍，讓你建立一個更合適的標準曲線。標準曲線稀釋方法舉例（你用的實際步驟可能與此區別很大，只把這個例子作 為參考）在下表中的稀釋步驟描述了一個 3X, （3X50 1）制備過程，以表

27、達最能模擬未知樣 品制備的實際情況。這個表包括了：加入有機溶劑做蛋白沉降。標準樣品的制備 和用丁分析的注入的體積，應該反映未知樣品的分析工作。稱出大約1毫克的參考標準，并重組為一個10 ug/毫升，稱量不到1毫克可能增大 稱重誤差的可能性并傳遞誤差。 一些疏水化合物可能要求兩步的重組。例如，一種疏水化合物可能不能溶丁含水量高的溶液。試著在少量的DMSO中溶解這種化合物，然后在含最低量有機溶劑的溶液（這時化合物是穩定和可溶的）中重組。 供應這些化合物用以評估的藥用化學家，常常給出你關丁溶解度和穩定性的建 議。（警告：這種稀釋方法可能會出錯，你必須驗證它。）參考標準濃度=10國/毫升（在不含血活的

28、溶液中制備）溶液 A = 1 g/ml （100 l套考標準+ 900 h血活）溶液B = 100 pg/ml （10 l拳考標準 + 990 "血活）溶液 C = 10 pg/ml （10 l后考標準 + 9990 h血活）溶液D = 1 pg/ml （10 l浴液 B + 990加血活）序 導標準溶液Ifa#內標有祝溶劑XX30 pl+420 pl-and mixand mix15O0 fg/ml75 p) Sol D*75 pi30 pl+420 pl21 pg/mJ150 pl Sal D叩30 pl420 pl35pgfml75 pl SolC75 pl30 pl+420

29、pl410 pg/ml150 B SolCOpl30 pl+420 pl520pgJml30 pl Sol B120 Ml30 Ml420 pl650 pgfml-75 / SolB+75 Ml30.+420 pl780 pg/ml120 pl SqIB30 pl30+420 pl6100 pg/ml15 pl Sol A135 pl30 pl420 pl9200 pg/ml30 pfA-fr120 pl30 pl+420 pl10500 pg/ml75 pl Sot A+75 pl十420 pl111000 pg/ml150 pl S«l A*Opl30 pr+420 pl下載標準

30、曲線法 standardcurve.rar （4.23 KB）（注意這個稀釋程序可能有錯，你必須驗證它） 方法注意：1. 在加入有機物沉淀蛋白前，內標應與樣品充分混合。盡可能地加入低濃度有機相的內標，這樣不會引起永久的沉淀。如果可能的話，用在血活中制備的內 標儲液最好。2. 溶液A , B, C和D應該在血活中制備，這樣標準曲線的樣品更接近未知的、在基質中的實際樣品。3. 當創建標準曲線時，應避免系歹U的稀釋。因為如果在第一次稀釋時，如果 犯了一個錯誤，那么系列的稀釋將造成錯誤漫步在整個標準曲線上。4. 在配置溶液時，不要吸取 L的液體，更小的體積將導致更大的誤差。并且，確保你的移液管是校正過的。105. 用丁這個步驟的血活總量是12.7 mL。運行標準曲線: 由丁標準曲線常常跨越三個（濃度）數量級，通常，標準樣品從低濃度高濃度 依次做樣。這個步驟保證不受高濃度標樣的色譜交義污染。 在