1、質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征第1頁/共47頁載體的功能及特征載體的功能（P12）為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因提供在受體細胞中 擴增和表達能力注意：上述三大功能并非所有的載體分子都必須具備第2頁/共47頁載體的功能及特征載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性） 具有合適的篩選標記 具有較高的外源DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點 第3頁/共47頁質粒載體質粒的基本特征 定義：質粒是一類存在

2、于原核細菌和真菌細胞中，能獨立于寄主染色體而自主復制的共價、閉合、環狀DNA分子并被穩定遺傳的一類核酸分子。是處于生命與非生命的分界線上。（1）質粒常見于原核細菌和真菌中；（2）絕大多數的質粒是DNA型的，絕大多數的天然DNA質粒具有共價封閉、環狀的分子結構，即cccDNA；（3）質粒DNA的分子量范圍：1 - 100 kb第4頁/共47頁質粒的基本特征1.質粒的自主復制性：質粒能擺脫寄主細胞的DNA復制系統的束縛進行自主復制；質粒DNA上含有自己的復制起始區（ori），形成獨立的復制子結構根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴緊型復制控制的質粒 1 - 5拷貝 s

3、tringent plasmid松弛型復制控制的質粒 30 - 50 拷貝 relaxed plasmid第5頁/共47頁質粒的基本特征2.質粒的可轉移性：革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：接合型質粒：能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質粒等；非接合型質粒：不能在天然條件下獨立地發生接合作用。值得注意的是，某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。第6頁/共47頁質粒的基本特征3.質粒的不相容性：任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性

4、，不相容性的質粒組成不ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容相容性群。以大腸桿菌的質粒為例：第7頁/共47頁質粒的基本特征4.攜帶特殊的遺傳標記：野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質合成 抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義。第8頁/共47頁質粒的構建原因：天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點少遺傳標

5、記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數幾個野生型質粒構建而成的：pSC101 8.8 kb，拷貝數 5，四環素抗性標記基因 TcrColE16.5 kb，拷貝數 20 - 30，大腸桿菌內毒素標記基因 E1RSF2124ColE1衍生質粒，氨芐青霉素抗性標記基因 Apr第9頁/共47頁改造的原則（1）刪除不必要的DNA區域，盡量縮小質粒的相對分子質量（2）滅活某些質粒的編碼基因，應為非轉移性質粒，應為松弛型質粒（3）加入易于識別的選擇標記基因（4）引入具有多種限制性內切酶的單一識別位點（5）根據外源基因克

6、隆的不同要求，加裝特殊的基因表達調控元件構建過程（P14）第10頁/共47頁質粒的分類人工構建的質粒根據其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝質粒 突變拷貝數控制基因，拷貝數1000-3000，擴增基因低拷貝質粒 來自pSC101，拷貝數小于10，表達某些毒性基因溫敏質粒 在不同溫度下表現出拷貝數、整合等不同性質測序質粒 含有測序通用引物互補序列和多酶接頭（polylinker）整合質粒 裝有整合促進基因及位點，便于外源基因的整合穿梭質粒 裝有針對兩種不同受體的復制子，便于基因克隆表達質粒 裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件探針質粒 裝有報告基因，便于啟動子等元件的克隆篩選第11頁/共

7、47頁重要的大腸桿菌質粒載體松弛型復制 pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可擴增拷貝數 50 - 100 / cell用于基因克隆 第12頁/共47頁pUC18 / 19： 拷貝數 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序 裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA

8、GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII第13頁/共47頁重要的大腸桿菌質粒載體pUC18 / 19：正選擇標記 lacZ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb-半乳糖苷酶的a-肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBr5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-galClBrClBrONNO第14頁/共47頁重要的大腸桿菌質粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記 lacZ用于外源基因的高效表達 注意：T7和SP6啟動

9、子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等第15頁/共47頁質粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列三種方法制備質粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染堿溶法 質粒DNA純度底、快速、操作簡便沸水浴法 質粒DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間第16頁/共47頁氯化銫密度梯度離心法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體； 加溶菌酶裂解細菌細胞壁； 加CsCl和溴乙錠；超速離心過夜；在紫外燈下吸取

10、cccDNA；稀釋沉淀cccDNA。proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第17頁/共47頁堿溶法： 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體； 加溶菌酶裂解細菌細胞壁； 加NaOH和SDS的混合溶液，破膜釋放內含物； 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體DNA及大部分蛋白質； 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白質；乙醇或異丙醇沉淀水相質粒DNA；用無DNase的RNase去除殘余的RNA。 cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第18頁/共47頁沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的加溶菌酶裂解細菌細胞壁； 沸水浴40秒鐘；離心，用無

11、菌牙簽挑去沉淀物； 乙醇或異丙醇沉淀質粒DNA。緩沖液懸浮菌體； 第19頁/共47頁另一類載體 噬菌體或病毒DNA 噬 菌 體 或 病 毒 是 一 類 非 細 胞 微 生 物 ， 能 高 效 率 高 特 異 性 地 侵 染 宿 主細 胞 ， 然 后 或 自 主 復 制 繁 殖 ， 或 整 合 入 宿 主 基 因 組 中 潛 伏 起 來 ， 而 且 在一定的條件下上述兩種狀態還會相互轉化。 噬 菌 體 或 病 毒 的 上 述 特 性 使 得 它 們 的 D N A 能 被 開 發 成 為 基 因 工 程 的有用載體，因為： 高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞； 自主復制繁殖性能使外源基因

12、在受體細胞中高效擴增。第20頁/共47頁l 噬菌體的生物學特性：生物結構l 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體l 噬菌體由外殼包裝蛋白和l-DNA組成 l-DNA全長48502個核苷酸l-DNA上至少有61？個基因l雙鏈噬菌體DNA載體第21頁/共47頁l 噬菌體生物學特性： 生物結構5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l - DNA第22頁/共47頁l 噬菌體生物學特性： 感染周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解第23頁/共

13、47頁l 噬菌體生物學特性： 感染周期體內包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75 - 105%即 36 - 51 kbDA第24頁/共47頁l 噬菌體生物學特性： 溶原狀態 l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態。整合主要由l-DNA上的cI和int兩基因的產物所激活，而這兩個基因的開放與關閉又取決于宿主細胞本身的性質。人們可以根據需要改變l-DNA或宿主細胞的性質，使噬菌體或處于溶菌狀態，或處于溶菌狀態。 DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶原狀態第25頁/共47頁l-DNA重組分子的體外

14、包裝： l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞。 用于體外包裝的蛋白質可直接從感染了l噬菌體的大腸桿菌中提取，現已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組l-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組l-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。第26頁/共47頁-DNA載體的構建：縮短長度 野生型l-DNA包裝的上限為51kb，本身長度為48.5kb，只有當插入的外源DNA片段不大于2.5kb時，才能被包裝成有感染力

15、的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l-DNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型l-DNA上約有40-50%的片段是復制和裂解所非必需的。根據切除的多少，可將l-DNA分成兩大類載體： 插入型載體取代型載體第27頁/共47頁取代型 （Replacement vectors）這種載體具有兩個對應的酶切克隆位點，在兩個位點之間的DNA區段是噬菌體的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 載體：克隆能力大，2025kb插入型 （Insertion vectors ）這種載體僅僅有一個可供外源DNA插入的克隆位點。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，一般不到10kb-DNA載體的主要類

16、型：第28頁/共47頁-DNA及其重組分子的分離純化：P22將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養基中培養至對數生長期 加入l噬菌體或重組l噬菌體的懸浮液，37培養1小時 用新鮮培養基稀釋，繼續培養4 -12小時。這時噬菌體顆粒 密度已達1013 -1014 / L，大腸桿菌細胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀l-DNA 第29頁/共47頁l-DNA作為載體的優點：l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌 l-DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質粒的裝載量 重組l-DNA分子的篩選較為方便 重組l-DNA分子的提取較為簡便 l-DNA載體

17、適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達 外源基因第30頁/共47頁單鏈噬菌體DNA載體噬菌體的生物學特性： 生物結構M13噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成 M13 DNA全長6407個核苷酸M13 DNA上至少有10個基因2700個VIIIM13 噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長 IIIVIVIIXI第31頁/共47頁M13 DNA“+”鏈進入雄性大腸桿菌合成“-”鏈產生雙鏈M13 DNA（復制型DNA或RF-DNA）按環狀雙鏈DNA方式復制，同時以“+”鏈DNA為模板轉錄包裝蛋白 RF-DNA達200拷貝時，單鏈DNA特異結合蛋白與“+”鏈結合而阻斷合成“

18、-”鏈結果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈 “+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體擠出受體細胞宿主細胞不被溶菌。M13噬菌體的生物學特性： 感染周期第32頁/共47頁載體的構建：III VI I IV II X V VII IX VIII野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體lacZpolylinker第33頁/共47頁M13 DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，

19、混濁斑的混濁度亦越大 但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb第34頁/共47頁 與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病 毒基因組DNA。 動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結構，可將動植物病毒分成四大類： 單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒 RNA病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規的DNA重組。插曲插曲第35頁/共47頁質粒與噬菌體雜合載體 l - D N A 載 體 和 M 1 3 - D N A 載 體 的 裝 載 量 最 大 分 別 為 2 5 k b 和 1

20、. 5 k b ，但 在 很 多 情 況 下 ， 往 往 需 要 克 隆 更 大 的 外 源 D N A 片 段 ， 考 斯 質 粒 和 噬菌粒載體的構建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。 在 包 裝 上 限 固 定 的 條 件 下 ， 大 幅 度 縮 短 噬 菌 體 D N A 的 長 度 ， 就 能同 步 增 加 載 體 的 裝 載 能 力 。 將 噬 菌 體 D N A 與 包 裝 有 關 的 序 列 與 質 粒 組裝 在 一 起 ， 既 能 最 大 限 度 地 縮 短 載 體 的 長 度 ， 同 時 又 能 保 證 重 組 D N A分 子 在 體 外 仍 被 包 裝 成 有 感

21、 染 力 的 顆 粒 ， 這 便 是 構 建 考 斯 質 粒 和 噬 菌粒載體的思路。當然，由于考斯質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。第36頁/共47頁考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的構建： 考 斯 質 粒 是 一 類 人 工 構 建 的 含pHC796400 bpTcrl fragmentcosoriAprPstIBamHISalI有 l - D N A c o s 序 列 和 質 粒 復 制 子 的殊 類 型 的 載 體 ， 1 9 7 8 年 由 C o l l i n s由 含 c o s 序 列 的 1 . 8 k b 的 l 片

22、段 和 考斯質粒的裝載范圍為31-45kb。和 H o h n 發 明 構 建 。 例 如 ， p H C 7 9質粒pBR322片段組合而成。第37頁/共47頁考斯質粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易不能體內包裝，不裂解受體細胞第38頁/共47頁噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒載體的特點： 噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體。能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉染受

23、體細胞 裝載量比常規的M13mp系列要大很多（10 kb）能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA概念：25頁第39頁/共47頁重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118：pUC18 + M13間隔區 IGpUC119：pUC19 + M13間隔區 IG500 個拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示M13輔助噬菌體DNA第40頁/共47頁重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉錄載體pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬 菌 體 啟 動 子 PT 3和 PT 7強 化 外 源 基 因 的轉 錄 ， 提 取 出 來 的 單 鏈 D N A 重 組 分 子在 噬 菌 體 R N A 聚 合 酶 的 存 在 下 ， 又 可實現外源基因的體外轉錄。第4