1、定義定義乳酸菌是指一群通過發酵糖類產生大量乳酸的細菌通稱。乳桿菌屬雙歧桿菌屬鏈球菌屬的嗜熱鏈球菌第1頁/共30頁本標準與本標準與GB/T 4789.35-2008GB/T 4789.35-2008相比，主要相比，主要變化如下：變化如下： 修改了乳酸菌總數、乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的計數方法。 本標準的附錄A為規范性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發布情況為： GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。第2頁/共30頁GB/T 4789.352003乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗流程第3頁/共30頁 SN/TSN/T 1941.1-20

2、07:檢驗方法有三部分：第1部分：分離與計數方法；第2部分：PetrifilmTM測試片法；第3部分：乳桿菌的PCR法第4頁/共30頁SN標準第5頁/共30頁GB/T 4789.35GB/T 4789.3520082008乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗修訂乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗修訂本標準與GB/T 4789.352003相比主要修改如下：將選擇性分離培養基由改良TJA 培養基（改良番茄汁瓊脂培養基）改為MRS培養基；增加API 50CH 診斷試劑條；乳酸菌計數由傾注法改為涂布法。第6頁/共30頁 2010版第7頁/共30頁樣品制備樣品制備 固體和半固體食品：以無菌操作稱取25 g 樣品，置于裝有225

3、 mL 生理鹽水的無菌均質杯內，于8000 r/min10000 r/min 均質1 min2 min，制成1:10 樣品勻液；或置于225 mL 生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min 制成1:10 的樣品勻液。 液體樣品：液體樣品應先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL 放入裝有225 mL 生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10 的樣品勻液。第8頁/共30頁乳酸菌計數乳酸菌計數 乳酸菌總數乳酸菌總數 根據待檢樣品活菌總數的估計，選擇2 個3 個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL 樣品勻液分別置于2 個MRS瓊

4、脂平板，使用L 形棒進行表面涂布。361，厭氧培養48 h2 h后計數平板上的所有菌落數。從樣品稀釋到平板涂布要求在15min 內完成。第9頁/共30頁乳酸菌計數乳酸菌計數 雙歧桿菌計數雙歧桿菌計數 根據對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2 個3 個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液于莫匹羅星鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS 瓊脂平板，使用滅菌L 形棒進行表面涂布，每個稀釋度作兩個平板。361，厭氧培養48 h2 h 后計數平板上的所有菌落數。第10頁/共30頁乳酸菌計數乳酸菌計數 嗜熱鏈球菌計數嗜熱鏈球菌計數 根據待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數的估計，選擇2 個3 個連

5、續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別置于2 個MC 瓊脂平板，使用L 形棒進行表面涂布。361，需氧培養48 h2 h后計數。嗜熱鏈球菌在MC 瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm1mm，菌落背面為粉紅色。第11頁/共30頁乳酸菌計數乳酸菌計數 乳桿菌計數乳桿菌計數 乳酸菌總數結果減去 雙歧桿菌與 嗜熱鏈球菌計數結果之和即得乳桿菌計數。第12頁/共30頁報告（報告（GB/T4789.35-2008） 根據菌落計數結果出具檢測報告。最終確定的乳酸菌菌落在根據菌落計數結果出具檢測報告。最終確定的乳酸菌菌落在3030300300之間的平板計數，

6、再乘以相應的稀釋之間的平板計數，再乘以相應的稀釋倍數，修約保留兩位有效數字，之后的數字，采用倍數，修約保留兩位有效數字，之后的數字，采用1010的指數表示。參照的指數表示。參照GB/T 4789.2GB/T 4789.2規定。每克（或毫升）規定。每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌數以食品中所含有的乳酸菌數以CFU/gCFU/g（mLmL）表示。表示。 第13頁/共30頁報告（報告（GB4789.35-2010） 選取菌落數在30 CFU300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數，大于300 CFU 的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用

7、兩個平板的平均數。 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。 當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。第14頁/共30頁結果的表述結果的表述 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）中菌落總數結果。 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式（1）計算：第15頁/共30頁第16頁/共30頁 若所有稀釋度的平板上菌落數

8、均大于300 CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。 若所有稀釋度的平板菌落數均小于30 CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1 乘以最低稀釋倍數計算。 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30 CFU300 CFU 之間，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 時，則以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。第17頁/共30頁菌落數的報告菌落數的報告 菌落數小于100 CFU 時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。 菌落

9、數大于或等于100 CFU 時，第3 位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2 位數字，后面用0 代替位數；也可用10 的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。 稱重取樣以CFU/g 為單位報告，體積取樣以CFU/mL 為單位報告。第18頁/共30頁第19頁/共30頁第20頁/共30頁第21頁/共30頁3M petrifilm第22頁/共30頁乳酸菌的鑒定 純培養 挑取3個或以上的可疑菌落，嗜熱鏈球菌接種于MCMC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRSMRS瓊脂平板，兼性厭氧，置36 36 11恒溫箱內培養48 48 h h2 h2 h。雙歧桿菌屬鑒定按照GB/T 4789.34GB/T 4789.34。第23頁/共30頁涂片鏡檢 乳桿菌屬細胞形態多樣，從長的桿狀和細長桿狀到彎曲桿狀及短桿狀，一般形成鏈。通常不運動。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌形態為球形或球桿狀，直徑為0.5 0.5 mm2.0 2.0 mm，細胞成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。第24頁/共30