1、熒光原位雜交(FISH)探針的制備及其應(yīng)用 概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征2、染色體異常常見(jiàn)的類型3、染色體異常的檢測(cè)方法二、熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理2、熒光原位雜交的探針三、熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交(按試驗(yàn)流程介紹)一、 概述1、克隆性染色體異常是腫瘤的特征1914年德國(guó)遺傳學(xué)家Boveri就提出染色體畸變與腫瘤起源相關(guān)，然而這還僅僅只是一個(gè)假說(shuō)；1960 年 Nowell 和 Hungerford 在 7 例慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia , CML) 的患者中發(fā)現(xiàn)后來(lái)被稱為費(fèi)城染色體(Philadelphia chro

2、mosome )的微小染色體；1973年Rowley證實(shí)了 Ph染色體是9號(hào)和22號(hào)染色體易位所致，這是人們?cè)谀[瘤中認(rèn)識(shí)到的第一 個(gè)染色體易位；目前，已經(jīng)有 11,500篇文獻(xiàn)報(bào)道了 55,600多種克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常。這 些染色體畸變，尤其是染色體易位及其相應(yīng)的融合基因在腫瘤致病的起始階段有著重要的作 用，無(wú)不說(shuō)明克隆性細(xì)胞遺傳學(xué)異常是腫瘤的特征，在腫瘤起源中起重要作用。60.0001Database last updated on November 04h 2008Total number of cases = 55.64850,000 -i40.000 -30.00020.000 i1

3、0,000 -1975198519901995200020052010YearFigure 11 The number of cytogenetically abnormal neoplasms reported in the Literature.下圖是各種疾病報(bào)告的克隆性染色體異常病例數(shù)The number of cases with clonal chromosome abnormalities in various diseases,Nat Rev Cancer, 2007, 7(4):233-245 AMI (n=12.124)a MDS (rr=4.008)E9 CML(n=2.9

4、99) CMD(n= 1.180) ALL (n-7.194)c (n=ZS04) T-ML (n=L094) HD (r=231) Respiratory system (n=7S9)口 Digestive system (n=I.B4) Breast (n=799) Female genital organs (n=790) MaI? genital organs n=297) Urinary tract (n=l,590) Endocrine system (n=lS0)口 Nervous system n= 1,416) Sktn (ns264) Booe(n=570) Soft ti

5、ssue (n= 1.169)2、染色體異常的常見(jiàn)類型染色體異常指數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常兩類：前者包括整條染色體數(shù)目的擴(kuò)增和缺失；后者包括染色體易位、插入、倒置、區(qū)帶的缺失或擴(kuò)增等。下圖是染色體數(shù)目異常染色體結(jié)構(gòu)異常duplicationunbalancedtranslocationbalancedtranslocationinsertiondeletion(pericentric)inversion3、染色體異常的檢測(cè)方法染色體異常的識(shí)別得益于二十世紀(jì)六十年代后發(fā)展起來(lái)的胰蛋白酶-姬姆薩染色和常規(guī)顯帶技術(shù)，使得常規(guī)篩查全基因組染色體異常和檢測(cè)染色體核型改變成為可能。染色體顯帶是細(xì)胞遺傳學(xué)分析技術(shù)

6、中標(biāo)準(zhǔn)和常用的方法，但耗時(shí)且依賴于獲得良好的分裂相，還難于分析復(fù)雜和隱匿的異常。Figure 191 The Jevolirtion, of karyarypingTo the Iflft h the karyotype described by Tia and Levan, establishing the human chromosome number js 46r to the right 沼 a nornidl hurnan femile kc'yotype. out ：in-d by binding technique.PCR或熒光原位雜交(FISH, fluorescent

7、 in situ hybridization )對(duì)染色體異常的檢出依賴于引物或探 針與模板的結(jié)合，因此較常規(guī)顯帶具有更高的特異性，是高通量檢測(cè)染色體異常的敏感和特異的方法。Detection of chromosome aberration:-0如建M aitufe-0 板 *u4» l*ufci*rhaaH一 bui . mown vMOh nw»Labour inloftfiv* wtih low IhroughputEx呻 sgFISH specific*6 jido. I 1 m&rrph,wr s.-rlli-PCR - speaFic* Rhmtv* D

8、na w Rna* Hjh Ihr-oughpul 命*Detection of specific genetic abnonnali熒光原位雜交及其探針1、熒光原位雜交的原理染色體熒光原位雜交始于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA技術(shù)的結(jié)合，這種結(jié)合開(kāi)創(chuàng)了一門新的學(xué)科一-分子細(xì)胞遺傳學(xué)。其基礎(chǔ)是 Southern blot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標(biāo)記或以熒光素直 接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA,通過(guò)熒光標(biāo)記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來(lái)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)。FISH具有

9、快速靈敏、特異性好的特點(diǎn)，可同時(shí)分析分裂期和間期的多個(gè)細(xì)胞，并進(jìn)行定量；可以檢測(cè)隱匿或微小的染色體畸變以及復(fù)雜核型；還可以使用多種熒光標(biāo)記，顯示 DNA片段及基因之間的相對(duì)位置與方向，空間定位精確。2、熒光原位雜交探針的類型FISH技術(shù)種類甚多，發(fā)展迅速，其實(shí)現(xiàn)需要獲得能與靶序列互補(bǔ)結(jié)合的探針。常用的探針有以下三 類：1、染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒a-衛(wèi)星DNA重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序列探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目異常，同時(shí)由于 G顯帶時(shí)，端粒區(qū)是蒼白的，因此涉及此區(qū)的易位常難以檢測(cè)，而 應(yīng)用端粒探針則彌補(bǔ)了 G顯帶的不足；2、染色體涂染探針，包括通過(guò)流式分選或顯微切割獲得的全 染色體或染

10、色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測(cè)染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常； 3、染色體單一序 列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)、細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC )、P1 人工染色體(P1 artificial chromosome, PAC ) 探針，主要用以識(shí)別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。a-衛(wèi)星DNA (alpha satellite DNA)是唯個(gè)存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA(centromere DNA , CEN-DNA)家族，由171bp的

11、單體為單位組成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百 次至數(shù)千次，跨越長(zhǎng)達(dá)100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號(hào)。因此常被選為著 絲粒探針的來(lái)源。Acentricheterochromatin J 1 klnetochore microtubules 一centromere/ 'i x/ x/ AB higher-order repeat (0.17 kt>)alphold monomer (171 bpt AT)Figure t. Srrucuirancl Organization ol tlw Kim mchor-!and Cemrotnenc DNAThe Well

12、come Trust Sanger Institute ( Hinxton, Cambridge )由 Wellcome Trust 和 British MedicalResearch Council聯(lián)合建立，是世界上較早開(kāi)展人類基因組大規(guī)模測(cè)序并具有相當(dāng)實(shí)力的測(cè)序中心。該中心利用能容納大片段人類基因組 DNA的高容量載體(如粘粒、BAC、PAC等)構(gòu)建了大片段人類 基因組DNA文庫(kù)，通過(guò)文庫(kù)中末端相互重疊的 DNA片段連接成疊連群(contig)并與鳥槍法相結(jié)合，加快了基因組測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了人類基因組計(jì)劃(Human Genome Project, HGP)中人類基因組的物理作圖(physica

13、l mapping )和基因組測(cè)序相結(jié)合的目標(biāo)。因此，這些克隆文庫(kù)為基因定位研究提供了 豐富的 DNA 序列資源，NCBI Clone Registry (/genome/clone/ )、Ensembl Genome Browser(/index.html )和 UCSC Genome Bioinformatics (/ ) 提供的網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)資源也記載了許多克隆基因組定位的詳細(xì)信息，為我們選擇相應(yīng)克隆為作為染色體單一序列和端粒探針的來(lái)源提供了便利。大片段

14、人類基因組 DNA文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程transfect E CeltFlquiM 21: From to BAC常用的BAC、PAC文庫(kù)Tabto 1 Sources of clones usedLibraryClonB& in cunerrt whole-genome mapTypeVOdorEnzymeAcrygfj riS£ir1曲xgRPChJ, S56BPACPCYPAC2iieRPCi ir272.027BACP0AC«35EkjW174pTARB>VC：tMbdi應(yīng)RPCI 13-saostRACi£AC«3.6Mbol crDI

15、CT A心228BACueekjBACiHnOW120CT-C, 'DTtBftCpBctaCACl iHndW125CT-D2tS59BACifietoBACi t£toRj190Otherfi10231"rnp-Z HVE chcx：;嚀 rgwf lRPCt-111 V&grnfirft &§ Va* .-us. dor-t s ftmit。心 brvira 孰irrt by cotaborq ce-:回-人類基因組的鳥槍法測(cè)序和物理作圖Grmc rruppKl 1099 由距；don»Mvt.n MQLiMUiq| FIS

16、H定位檢索BAG PAC克隆的常用數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC Genome Bioinforinatics http:genome ucac cdu/En喜GEbf Ge no rne Rrov srhttp：/vvww.erisemb org/index htrrii熒光原位雜交探針的制備和熒光原位雜交 實(shí)驗(yàn)流程英尤顯微鐐下觀斑滴片捅的擴(kuò)修:機(jī)粒提IRDAP俄染老化RMaseit登性勒| V移 問(wèn)翩針探物沉淀煲件Avidm-Texas Red 或 Arti-DIG- Ftuorescein 37 TJ W fl30minAnti-Avidm Texas Red 或 Anti- mouse-lg-DlGS

17、ZXUfr? fl'40min次01C睇度乙用脫水篋宜性Av id in-Texas Red 或anti- DigoxinAb 37T?蟋育胃螢白8»清化彖文過(guò)夜¥籍囂狒3既心5氟 V4XSSC 5rru5X3iX第一天缺口平移標(biāo)記探針1.1試劑準(zhǔn)備(1) 0.1mmol/L dNTP0.3mmol/L dA TP、0.3mmol/L dCTP 和 0.3mmol/L dGTP 等體積混合。(2) 0.1mmol/L dTTP1倍體積的0.3mmol/L dT TP和2倍體積的三蒸水混合。1.2缺口平移體系和反應(yīng)條件0.1mmol/L dT TP 6.5 卬 10.

18、1mmol/L dNTP 10 卬 110 x Nick Translation buffer 511mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16- dUTP 0.51Nick Translation Enzyme 101DNA (1 i g) X i 1H2O 18-X m 1in total 501以上為標(biāo)記1卬g DNA的缺口平移體系，若標(biāo)記更多量的DNA,則試劑量和反應(yīng)體系相應(yīng)等倍擴(kuò)大。各成分混勻后短時(shí)離心。對(duì)于 < 10kb的質(zhì)粒，于15C反應(yīng)3.5小時(shí)；對(duì)于BAC/PAC,于15C反應(yīng) 9小時(shí)。1.3凝膠電泳判斷探針大小將EP管置于冰上，取其中5卬l于70C加熱

19、5分鐘后行2 %瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標(biāo)記探針的大 小，單一序列探針合適大小為200 600bp ;如片段大小偏大，則于15C延長(zhǎng)反應(yīng)1030分鐘，再重復(fù)進(jìn)行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。1.4終止反應(yīng)向反應(yīng)體系中加入1卬l 0.5M EDTA和(或)70C加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20C保存?zhèn)溆?。第二?. 探針的沉淀和變性1.1探針混合物的組成(1) 對(duì) BAC/PAC 探針DNA探針5ulHuman Cot-1 DNA 3ulSalmon Sperm DNA 0.5ulH2O 1.5ulin total 10ul(2) 對(duì)著絲粒探針：DNA探針5ulSalmon Sperm DN

20、A 0.5ulH2O 4.5ulin total 10ul1.2 DNA的沉淀將探針混合物與 1ul (V/10 ) 3M醋酸鈉(PH5.2)和27.5ul (2.5V)無(wú)水乙醇(-20 C凍存)混合，-80C沉淀30min (或-20 C沉淀過(guò)夜)，以14000g在4C離心30min，以沉淀DNA。1.3清洗沉淀小心棄去上清，用 70 %乙醇洗滌一次，再次以 14000g在4C離心15min ;小心棄去上清，在 45 50C的中溫水浴中風(fēng)干 DNA沉淀1015min。注：當(dāng)大部分乙醇蒸發(fā)時(shí)，白色的DNA沉淀變?yōu)榘胪该鳡?；一定要徹底清除乙醇，否則會(huì)在加入MasterMix后產(chǎn)生微小的沉淀，導(dǎo)致

21、高背景。1.4溶解探針加入5卬l預(yù)熱至37C的去離子甲酰胺（PH 7.0 ），短時(shí)離心后在37C振搖30min以充分溶解DNA; 再加入預(yù)熱至37C的Master Mix 5卬,1短時(shí)離心后在 37C振搖1530min。注：振搖時(shí)間盡可能延長(zhǎng)；DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1卬溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4卬稀釋， 混勻后瞬時(shí)離心，37C振搖1530min。1.5探針的變性和預(yù)雜交短時(shí)離心后于80 C水浴中變性探針10min,冰浴5分鐘；短時(shí)離心，于37 C水浴中預(yù)雜交3060min ； 獨(dú)特序列探針（如cDNA）和重復(fù)序列探針（如 a-衛(wèi)星DNA）探針，無(wú)需預(yù)雜交。2. 標(biāo)本（染色體靶

22、 DNA）的處理和變性2.1滴片和老化取出儲(chǔ)存于-20C的細(xì)胞懸液標(biāo)本，以1100 rpm.離心10min沉淀細(xì)胞，換用適量體積的新鮮甲醇：冰 乙醇（v/v） =3:1固定液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度， 滴片，劃出雜交區(qū)域，晾干；在預(yù)熱到 37 °C的 2 XSSC中老化30min （也可實(shí)驗(yàn)前夜室溫過(guò)夜老化再以 2 x SS（M泡2分鐘）；依次于70 %、90 % 和100 %的梯度乙醇中依次脫水，每缸 2min,晾干（以下略作 梯度乙醇脫水后涼干”）。2.2 RNase A 消化每張玻片上加 30卬l 100卬g/ml RNAI （將10mg/ml的RNase A儲(chǔ)存液稀釋100倍）

23、，蓋上22 x22mm 蓋玻片，置于37C濕盒中孵育1小時(shí)；室溫下2X SSC中振蕩洗滌，5min/次X3次；梯度乙醇脫水后 涼干。2.3靶DNA的變性將玻片放入預(yù)溫至72 °C （每增加一張玻片，溫度要提高1C）的70 %去離子甲酰胺/2 X SSC變性2 分鐘后，立即置入預(yù)冷至-20 C保存的梯度乙醇脫水晾干。2.4蛋白酶消化將50卬l 100 mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為 0.01 %）加入預(yù)溫至37C的50ml蒸偕水（PH 2.0,以適 量稀鹽酸酸化）中，混勻；將變性后的玻片放入其中處理 10分鐘；室溫下1XPBS中振蕩洗滌，5min/ 次X2次；室溫下梯度乙醇脫水后涼干。

24、注：靶DNA的變性和消化應(yīng)與探針變性同步進(jìn)行，完成后盡快進(jìn)行雜交。3. 雜交將變性后的DNA探針加于玻片雜交區(qū)域，蓋上 22m心22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37 C雜 交過(guò)夜。第三天1. 雜交后洗滌和半抗原信號(hào)放大1.1雜交后洗片小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預(yù)熱至 46 C的50 %甲酰胺/2 X SSC, 5minx3缸；將玻片 移入室溫下4XSSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5minx 2缸；每張玻片滴加 30卬1阻斷液1,蓋上 22mmx 22mm蓋玻片，于 37C濕盒中孵育30min ;再次將玻片移入室溫下 4 x SSC/0.1 % Tveen-20 中振蕩洗滌5minx 2缸。注：此后步驟應(yīng)注意避光操作。1.2滴加一抗將 41 Ant-DIG monoclonal antibody 和 0.5 卬 l Txas-red-Avidin 稀釋于 100 卬 l抗體稀釋液 1 中，混勻；每張玻片滴加25卬l于雜交區(qū)