1、第四章第四章基因文庫的建立基因文庫的建立基因文庫基因文庫(genelibrary)基因組文庫基因組文庫(genomiclibrary)cDNA文庫文庫(cDNAlibrary)第一節第一節基因組文庫的構建基因組文庫的構建定義：定義：含有某種生物全部遺傳信息的重組含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。分子的克隆總和。一一.基因組文庫的規?；蚪M文庫的規模N基因組文庫克隆總數基因組文庫克隆總數P所需機率所需機率N=f插入片段與基因組插入片段與基因組DNA長度之比長度之比二建立基因組文庫的一般程序二建立基因組文庫的一般程序1載體載體DNA片段的制備片段的制備DNA分離純化分離純化限制酶

2、切限制酶切脫磷酸化反應脫磷酸化反應2供體供體DNA片段的制備片段的制備總總DNA分離純化分離純化機械剪切法機械剪切法分離特定大小分離特定大小DNA片段片段酶法酶法部分酶切部分酶切分離特定大小分離特定大小DNA片段片段完全酶切完全酶切ln（1-P）ln（1-f）用不同生物的完全基因組構建的基因組文庫用不同生物的完全基因組構建的基因組文庫應具有的克隆數和實際克隆數應具有的克隆數和實際克隆數 3.供體與載體供體與載體DNA連接連接要提高重組頻率，應注意連接反應體系中的總要提高重組頻率，應注意連接反應體系中的總DNA濃濃度和兩種度和兩種DNA分子的克分子比率。分子的克分子比率。4.重組重組DNA分子的

3、轉移和基因組文庫的擴增分子的轉移和基因組文庫的擴增利用轉化或感染方法將連接利用轉化或感染方法將連接DNA分子導入宿主細胞，分子導入宿主細胞，讓其自主復制，重組讓其自主復制，重組DNA分子被擴增（重組子比率可能分子被擴增（重組子比率可能發生變化）發生變化）5.基因組文庫質量的評價基因組文庫質量的評價1）文庫規模）文庫規模-隨機挑取一些轉化子或重組子，提取質隨機挑取一些轉化子或重組子，提取質粒粒DNA，電泳測定插入片段大小，然后根據上述公式計，電泳測定插入片段大小，然后根據上述公式計算文庫大小。算文庫大小。2）重組頻率）重組頻率-頻率越高，質量越高，可大大減輕后續頻率越高，質量越高，可大大減輕后續

4、篩選基因工作量。篩選基因工作量。三三.利用質粒載體利用質粒載體構建基因組文庫構建基因組文庫BamHIMboIOHPOHHO脫磷酸化重組DNAT4 連接酶轉化E.coli基因組文庫總DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI該法簡單、快速、易于該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。四四.利用利用載體構建基因組文庫載體構建基因組文庫1.載體載體DNA片段的制備方法片段的制備方法:左右臂左右臂DNA片段

5、的獲得片段的獲得2.供體供體DNA片段的制備片段的制備:限制酶部分酶切，機械剪切法限制酶部分酶切，機械剪切法3.重組重組DNA分子的形成：分子的形成：控制克分子比率，使其形成串狀控制克分子比率，使其形成串狀DNA分子分子4.重組重組DNA分子的包裝分子的包裝1）DNA的包裝物的制備的包裝物的制備使用的大腸桿菌菌株：使用的大腸桿菌菌株： E.coliBHB2688(N205recAimm434cItsb2redEamSam/)-包裝蛋白包裝蛋白 E.coliBHB2690(N205recAimm434cItsb2redDamSam/)-頭部蛋白頭部蛋白i.兩菌株分別培養，分別收集和制備，包裝前混

6、合兩菌株分別培養，分別收集和制備，包裝前混合-本底低（對本底低（對DNA分子大小有嚴格限制），高效。分子大小有嚴格限制），高效。ii.兩菌株分別培養，混合收集和制備兩菌株分別培養，混合收集和制備-操作簡單，操作簡單，本底高，可包裝不同大小的本底高，可包裝不同大小的DNA分子。分子。2）重組重組DNA分子的包裝過程分子的包裝過程包裝制備物（包裝制備物（-70）于冰上緩慢融化）于冰上緩慢融化加入重組加入重組DNA分子分子邊融化邊混合邊包裝邊融化邊混合邊包裝離心除去離心除去細胞碎片細胞碎片顆粒于顆粒于-70保存待用保存待用5.基因組文庫的擴增基因組文庫的擴增包裝的包裝的顆粒顆粒感染感染E.coli培

7、養培養分離分離顆粒顆粒-70保存保存五五.利用利用COS質粒載體構建基因組文庫質粒載體構建基因組文庫構建過程與構建過程與載體構建過程相似載體構建過程相似:兩臂兩臂DNA片段的制備，片段的制備，供體供體DNA片段的制備，兩片段的制備，兩DNA的連接和重組的連接和重組DAN分子的包分子的包裝。裝。單單COS質粒載體質粒載體和和雙雙COS質粒載體質粒載體構建基因組文庫。構建基因組文庫。為提高文庫質量，可采取以下措施：為提高文庫質量，可采取以下措施：1.雙酶切載體產生不同末端以避免其自身形成串狀體雙酶切載體產生不同末端以避免其自身形成串狀體2.供體供體DNA脫磷酸化以避免供體脫磷酸化以避免供體DNA間

8、的連接導致重排間的連接導致重排3.載體和供體載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發生末端修飾以避免上述兩種情形發生載體載體DNAXhoIorSalI酶切酶切補補CT連接連接重組重組DNA供體供體DNASau3AI部分酶切部分酶切補補AG4.采用文庫快速構建法以避免擴增文庫時采用文庫快速構建法以避免擴增文庫時DNA丟失丟失AprOricosBHHind AprOricosBHCosHind AprOriBHAprOricosBHCosSal ISHHSCosSCosS1Bam H ISHHSCosSCosS1Bam H ICosS1Bam H IHCosS1Bam H ICosHCosCo

9、sHSSHSSH大片段小片段35-45kb DNA 片段T4 DNA ligaseCosHCosSoriAp r利用單利用單COS質粒載體文庫質粒載體文庫SS離體包裝感染E.coli利用雙利用雙COS質粒載體質粒載體構建基因組文庫構建基因組文庫 七七.利用利用YAC載體構建基因組文庫載體構建基因組文庫1.兩臂兩臂DNA片段的制備片段的制備:pYAC4BamHI/EcoRI脫磷酸化脫磷酸化2.供體供體DNA片段的制備片段的制備:瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠-DNA樣品的制備樣品的制備EcoRI部分酶切部分酶切脈沖場脈沖場凝膠電泳凝膠電泳片段回收和純化片段回收和純化3.DNA的連接的連接4.重組重組DAN

10、分子的轉化分子的轉化:原生質體轉化法原生質體轉化法5.轉化子的保存轉化子的保存:單菌落保存于單菌落保存于96孔平板中孔平板中Sup4CEN4ARS1TRP1OripYAC4ESmSXBXB紅色Ura+,Try+轉化子菌落脈沖場凝膠電泳酵母人工染色體構建酵母人工染色體構建建立基因組文庫的載體建立基因組文庫的載體 A鳥槍法鳥槍法5 目的基因的克隆與基因文庫的構建鳥槍法克隆目的基因的基本戰略鳥槍法克隆目的基因的基本戰略鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰略鳥槍法克隆目的基因的基本戰略 隨機克隆供體細胞的全基隨機克隆供體細胞的全

11、基因組因組DNA片段，然后通過快片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的中分離出含有目的基因的目的目的重組子重組子，進而獲得目的基因。，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離因的克隆分離鳥槍法克隆目的基因的基本戰略鳥槍法克隆目的基因的基本戰略染色體染色體DNA的切斷的切斷超聲波處理：超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端片段長度均一，大小可控，平頭末端全酶切：全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但可能使基片段長度不均一，粘性末端便于連接，但可能使基因斷開。因斷開。部分酶切：部分酶切：片段長

12、度可控，含有粘性末端，目的基因完整片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接與載體連接如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體選擇多拷貝克隆載體;如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體則選擇表達型載體l轉化受體細胞轉化受體細胞 如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉化子采篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的

13、基因表用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞達的受體細胞l篩選含有目的基因的目的重組子篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立）建立）鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中高

14、重組子中目的重組子目的重組子的出現頻率的出現頻率 使用特征性限制性內切酶切開染色體使用特征性限制性內切酶切開染色體DNA 鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8kb的的SalI片段中，將染色體片段中，將染色體DNA用用SalI切開，瓊脂糖凝膠切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于電泳分離，用刀片切下相當于1.6-2.0 kb大小區域內的凝膠大小區域內的凝膠塊，從此凝膠塊中回收塊，從此凝膠塊中回收DNA片片段，然后與載體進行拼接段，然后與載體進行拼接在連接前將在連接前將DNA片段進行分級分離片段進行分級分離 2.0 kb1.6 kb1.8 kb

15、鳥槍法操作的改進鳥槍法操作的改進凍融法凍融法濾紙法濾紙法吸附法吸附法低融點凝膠法低融點凝膠法溶解法溶解法凝膠凝膠DNA片段片段回收回收技術技術 鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的工作量較大，需要了解目的基因的背景知識背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內不能除去真核生物目的基因的內含子結構含子結構第二節第二節cDNA文庫的建立文庫的建立定義：定義：從一定生長階段或條件的某種細胞分離到的全部從一定生長階段或條件的某種細胞分離到的全部mRNA經反轉錄成經反轉錄成cDNA后再重組和增殖所產生的無性后

16、再重組和增殖所產生的無性繁殖系的總和。繁殖系的總和。一一cDNA文庫的特點文庫的特點1.基因特異性基因特異性常來自結構基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺常來自結構基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達的基因的遺傳信息：傳信息，且只代表那些正在表達的基因的遺傳信息：15%mRNA，8085%rRNA，1015%tRNA2.器官特異性器官特異性不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結構基因的不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結構基因的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的表達就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所所組建的組建的cDNA文庫也就不同文庫也就不同4

17、.不均勻性不均勻性在同一個在同一個cDNA文庫中，不同類型的文庫中，不同類型的cDNA分子的數分子的數目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉錄而目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉錄而來的。這與基因組文庫中的單拷貝基因均具有相同的來的。這與基因組文庫中的單拷貝基因均具有相同的克隆數相較，這是兩種文庫的另一差別。克隆數相較，這是兩種文庫的另一差別。5.各各cDNA均可獲得表達（一般選用的載體都是表達均可獲得表達（一般選用的載體都是表達型的）型的）3.代謝或發育特異性代謝或發育特異性處于不同代謝階段（或發育階段）的結構基因表達處于不同代謝階段（或發育階段）的結構基因表達亦不相同亦不相同二

18、二.cDNA文庫的規模文庫的規模N=f為某一特定為某一特定cDNA（mRNA）的分子數目與全部）的分子數目與全部cDNA（mRNA）分子數目之比）分子數目之比三三.建立建立cDNA文庫的一般程序文庫的一般程序1.載體載體DNA片段的制備片段的制備2.多聚（多聚（A）RNA的分離與純化的分離與純化3.雙鏈雙鏈cDNA的合成的合成1）單鏈）單鏈cDNA的合成：反轉錄法的合成：反轉錄法2）第二條）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除）法除去去RNA分子分子ln(1p)ln(1f)RNaseHDNAdNTP聚 合 酶DNAligase RNaseHRNaseH酶解取

19、代法酶解取代法cDNA法克隆目的基因的基本戰略法克隆目的基因的基本戰略mRNAc cDNA第一鏈的合成第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈第一鏈引物引物退火退火逆轉錄酶逆轉錄酶dNTPsc cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 煮沸煮沸NaOH自身引導法：自身引導法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA5端會有幾對堿基缺失端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTp 5TTTTTTTTTTTTTTp5TTTTTTTTTTTTTTp5AAAAAAAAAAAAAAOH3TTTTTTTTTTTTTTOH 3KlenowdNTPsS1c cDNA第二鏈的合成第二鏈的合成 DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：置換合成法：獲得的雙鏈獲得的雙鏈cDNA5端也會有幾對堿基缺失端也會有幾對堿基缺失5pp