1、實驗六實驗六 微生物生理生化反響察看微生物生理生化反響察看一、實驗目的一、實驗目的n初步了解微生物生化鑒定與分類的原理初步了解微生物生化鑒定與分類的原理與方法；掌握淀粉水解實驗、明膠水解與方法；掌握淀粉水解實驗、明膠水解實驗、尿素水解實驗、糖發(fā)酵實驗的原實驗、尿素水解實驗、糖發(fā)酵實驗的原理和方法。理和方法。二、實驗原理二、實驗原理1.1.淀粉酶能水解淀粉為小分子的糊精、雙淀粉酶能水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，而淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，糖和單糖，而淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，因此能產(chǎn)淀粉酶的微生物在淀粉培育基因此能產(chǎn)淀粉酶的微生物在淀粉培育基上培育用碘處置睬產(chǎn)生無色區(qū)域，據(jù)此上培育用碘處置睬產(chǎn)生無

2、色區(qū)域，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。2.2.明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在在2525以下可維持凝膠形狀，以固體方以下可維持凝膠形狀，以固體方式存在，而在式存在，而在2525以上明膠會液化。假以上明膠會液化。假設接種的微生物可以產(chǎn)生明膠酶就可以設接種的微生物可以產(chǎn)生明膠酶就可以使明膠生化管在使明膠生化管在25 25 以下發(fā)生液化，據(jù)以下發(fā)生液化，據(jù)此性質(zhì)可以鑒別產(chǎn)明膠酶的微生物。此性質(zhì)可以鑒別產(chǎn)明膠酶的微生物。3. 3. 尿素酶可以使尿素分解釋放出氨氣和二尿素酶可以使尿素分解釋放出氨氣和二氧化碳，氨溶于水使加有酚紅酸堿指示氧

3、化碳，氨溶于水使加有酚紅酸堿指示劑的營養(yǎng)瓊脂由中性變成堿性，從而產(chǎn)劑的營養(yǎng)瓊脂由中性變成堿性，從而產(chǎn)生顏色變化由黃色變成深粉紅色。生顏色變化由黃色變成深粉紅色。經(jīng)過生化管的顏色變化就可以判別接種經(jīng)過生化管的顏色變化就可以判別接種的培育基能否產(chǎn)生尿素酶。的培育基能否產(chǎn)生尿素酶。4 4、有些微生物可以分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生、有些微生物可以分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生有機酸乳酸、醋酸、丙酸使生化管有機酸乳酸、醋酸、丙酸使生化管的的PHPH值降低，從而使含酸堿指示劑溴甲值降低，從而使含酸堿指示劑溴甲酚紫的營養(yǎng)瓊脂由紫色變成黃色，經(jīng)過酚紫的營養(yǎng)瓊脂由紫色變成黃色，經(jīng)過生化管的顏色變化可以判別能否能產(chǎn)生生化管的顏色

4、變化可以判別能否能產(chǎn)生相應的糖水解酶類。相應的糖水解酶類。三、實驗步驟二人一組三、實驗步驟二人一組1.1.淀粉水解實驗：每人接種二支淀粉生化淀粉水解實驗：每人接種二支淀粉生化管分別接種大腸桿菌和枯草芽孢桿管分別接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，菌，3737培育培育2d2d，加盧革氏碘液察看，加盧革氏碘液察看和記錄每管顏色變化，得出結(jié)論。和記錄每管顏色變化，得出結(jié)論。2.2.明膠水解實驗：每人接種二支明膠生化明膠水解實驗：每人接種二支明膠生化管分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球管分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，菌，2020培育培育2 2天，從天，從2020取出即察看取出即察看和記錄各管的明膠水解情況，得

5、出結(jié)論。和記錄各管的明膠水解情況，得出結(jié)論。3.3.尿素水解實驗：每人接種兩支尿素生化尿素水解實驗：每人接種兩支尿素生化管分別接種變形桿菌和金黃色葡萄球管分別接種變形桿菌和金黃色葡萄球菌，菌，3737培育培育2 2天，察看和記錄每管培天，察看和記錄每管培育前后顏色變化，得出結(jié)論。育前后顏色變化，得出結(jié)論。 4 4、葡萄糖發(fā)酵實驗：每人接種二支葡萄糖、葡萄糖發(fā)酵實驗：每人接種二支葡萄糖生化管一支接種大腸桿菌、一支接種生化管一支接種大腸桿菌、一支接種變形桿菌，變形桿菌，3737培育培育2 2天，察看和記錄天，察看和記錄每管培育前后顏色變化，得出結(jié)論。每管培育前后顏色變化，得出結(jié)論。5 5、乳糖發(fā)酵

6、實驗：每人接種二支乳糖生化、乳糖發(fā)酵實驗：每人接種二支乳糖生化管一支接種大腸桿菌、一支接種變形管一支接種大腸桿菌、一支接種變形桿菌，桿菌，3737培育培育2 2天，察看和記錄每管天，察看和記錄每管培育前后顏色變化，得出結(jié)論。培育前后顏色變化，得出結(jié)論。四、實驗本卷須知四、實驗本卷須知n淀粉水解實驗，在察看時需求加盧革氏碘液以便察看淀粉的水解情況；n接種均在無菌條件下操作，接種終了以后用滅菌好的棉花塞住管口防止污染；n生化管用砂輪切割玻璃后接種。思索題思索題n接種后的明膠試管可以在接種后的明膠試管可以在37 37 下培育，下培育，在培育后他必需做什么才干證明水解的在培育后他必需做什么才干證明水解

7、的存在存在? ?n對他的實驗景象進展分析對他的實驗景象進展分析示示 教教n腸道致病菌的分別鑒定腸道致病菌的分別鑒定分別鑒定步驟分別鑒定步驟1 1、分別培育、分別培育糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別S-S平板平板培育培育大，紅色，非致病性菌大，紅色，非致病性菌菌落菌落小，無色半透明，為可小，無色半透明，為可疑菌落疑菌落糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別培育培育S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別培育培育S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別培育培育S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別大，紅色，

8、非致病性菌大，紅色，非致病性菌菌落菌落培育培育S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別小，無色半透明，為可小，無色半透明，為可疑菌落疑菌落大，紅色，非致病性菌大，紅色，非致病性菌菌落菌落培育培育S-S平板平板糞便標本糞便標本劃線劃線分別分別2 2、初步鑒定、初步鑒定選取可疑菌落選取可疑菌落轉(zhuǎn)種轉(zhuǎn)種半固體，雙糖鐵半固體，雙糖鐵培育基培育基培育培育察看培育基變化察看培育基變化3、進一步鑒定 對初步鑒定的菌種進一步做生化鑒定4、血清學鑒定 腸道桿菌型別較多，常需血清學方法進展確證5、藥敏實驗 為針對性治療提供根據(jù)一腸道桿菌的形狀、染色及在選擇培育一腸道桿菌的形狀、染色及在選擇培育基上的生長情況

9、基上的生長情況1、常見腸道致病菌菌種：傷寒桿菌、痢疾、常見腸道致病菌菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌等桿菌等2、選擇培育基：、選擇培育基：SS平板、平板、EMBSSSS瓊脂培育基選擇培育原理：瓊脂培育基選擇培育原理：n此培育基是強選擇性培育基中性紅為指示劑，酸性時此培育基是強選擇性培育基中性紅為指示劑，酸性時呈現(xiàn)紅色，堿性時呈淡黃色。呈現(xiàn)紅色，堿性時呈淡黃色。在此培育基上，大腸桿菌屬的菌落大而混濁，因發(fā)酵在此培育基上，大腸桿菌屬的菌落大而混濁，因發(fā)酵乳糖，菌落呈現(xiàn)紅色乳糖，菌落呈現(xiàn)紅色 n志賀氏菌屬和沙門氏菌屬的菌落形狀為光滑無色透明，志賀氏菌屬和沙門氏菌屬的菌落形狀為光滑無色透明，園形、中等大小，邊

10、緣整齊的菌落。由于宋內(nèi)氏痢疾園形、中等大小，邊緣整齊的菌落。由于宋內(nèi)氏痢疾桿菌有分解膽鹽中的某些物質(zhì)和發(fā)酵乳糖桿菌有分解膽鹽中的某些物質(zhì)和發(fā)酵乳糖( (產(chǎn)酸產(chǎn)酸) )較慢較慢等特點，而使菌落呈淡紅或紅色的較大或邊緣不整齊等特點，而使菌落呈淡紅或紅色的較大或邊緣不整齊的扁平菌落。某些沙門氏菌屬及變形桿菌因的扁平菌落。某些沙門氏菌屬及變形桿菌因 產(chǎn)生硫化產(chǎn)生硫化氫，使菌落呈現(xiàn)黑色中心。氫，使菌落呈現(xiàn)黑色中心。伊紅美蘭瓊脂培育基選擇伊紅美蘭瓊脂培育基選擇培育原理：培育原理：n此培育基為弱選擇性培育基。以伊紅美蘭作指示劑此培育基為弱選擇性培育基。以伊紅美蘭作指示劑n大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時染上伊紅，由于

11、伊紅大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時染上伊紅，由于伊紅和美蘭結(jié)合所以菌落不是紅色而呈現(xiàn)紫黑色，且有金和美蘭結(jié)合所以菌落不是紅色而呈現(xiàn)紫黑色，且有金屬光澤屬光澤( (大腸桿菌大腸桿菌) )或棕色或棕色( (產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)氣桿菌) )，扁平混濁，而，扁平混濁，而較大邊緣色淡的菌落。較大邊緣色淡的菌落。n致病菌的菌落為無色半透明、園形，中等大小，致病菌的菌落為無色半透明、園形，中等大小，邊緣整齊的菌落，在接近大腸桿菌的可疑菌落往往呈邊緣整齊的菌落，在接近大腸桿菌的可疑菌落往往呈現(xiàn)淡蘭色。現(xiàn)淡蘭色。 方法：方法：n1 1、分別培育、察看菌落特征：分別取四的、分別培育、察看菌落特征：分別取四的培育物，用分別劃線方法接

12、種培育物，用分別劃線方法接種SSSS平板或平板或EMBEMB培育基培育基3737培育培育18-24h18-24h以后察看結(jié)果。以后察看結(jié)果。n2 2、革蘭染色、察看形狀學特征：取各菌培、革蘭染色、察看形狀學特征：取各菌培育物少許涂片，革蘭染色、鏡檢。育物少許涂片，革蘭染色、鏡檢。菌落察看菌落察看沙門氏菌：無色透明菌落，有黑色中心沙門氏菌：無色透明菌落，有黑色中心志賀氏菌：無色透明菌落。志賀氏菌：無色透明菌落。腸道桿菌形狀學察看腸道桿菌形狀學察看二腸道桿菌生化反響及動力實驗二腸道桿菌生化反響及動力實驗n培育基：克氏雙糖斜面培育基、生化反響管、培育基：克氏雙糖斜面培育基、生化反響管、半固體培育基半

13、固體培育基克氏雙糖斜面培育基生化反響原理克氏雙糖斜面培育基生化反響原理 該培育基含葡萄糖與乳糖的比例為該培育基含葡萄糖與乳糖的比例為1:101:10，并含硫酸，并含硫酸亞鐵和指示劑酚紅。亞鐵和指示劑酚紅。大腸桿菌發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，所以上層呈黃色，大腸桿菌發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，所以上層呈黃色，直立段有氣泡存在直立段有氣泡存在腸道病原菌不能發(fā)酵乳糖，只能發(fā)酵葡萄糖，分解葡萄糖腸道病原菌不能發(fā)酵乳糖，只能發(fā)酵葡萄糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸，使產(chǎn)酸，使PHPH下降，因斜面部分先呈現(xiàn)黃色，由于葡萄糖下降，因斜面部分先呈現(xiàn)黃色，由于葡萄糖含量少，所生之酸接觸空氣而氧化，又因細苗的生長利含量少，所生之酸

14、接觸空氣而氧化，又因細苗的生長利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，所以斜面部分后來又變成用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，所以斜面部分后來又變成紅色由于直立段紅色由于直立段( (底層底層) )呈厭氧形狀，細菌發(fā)酵葡萄糖呈厭氧形狀，細菌發(fā)酵葡萄糖所生的酸不被氧化，所以不斷呈黃色。大腸桿菌產(chǎn)氣，所生的酸不被氧化，所以不斷呈黃色。大腸桿菌產(chǎn)氣，有動力有動力( (沿穿刺線向周圍分散生長沿穿刺線向周圍分散生長) )傷寒桿菌有動力，而傷寒桿菌有動力，而痢疾桿菌那么沒有動力痢疾桿菌那么沒有動力 某些細菌如變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能分解培育基中含某些細菌如變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能分解培育基中含硫氨基酸如胱氨酸產(chǎn)生硫化氫、硫

15、化氫與硫酸亞鐵硫氨基酸如胱氨酸產(chǎn)生硫化氫、硫化氫與硫酸亞鐵中的亞鐵離子結(jié)合構(gòu)成黑色的硫化鐵，而痢疾桿菌不產(chǎn)中的亞鐵離子結(jié)合構(gòu)成黑色的硫化鐵，而痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化鐵生硫化鐵 生化反響管原理生化反響管原理1 1n尿素實驗：此培育基鑒別沙門氏菌和變形桿菌屬尿素實驗：此培育基鑒別沙門氏菌和變形桿菌屬細菌，自鐵質(zhì)雙糖培育基上取菌苔作斜面接種，細菌，自鐵質(zhì)雙糖培育基上取菌苔作斜面接種，置置3737恒溫箱內(nèi)培育恒溫箱內(nèi)培育18241824小時同時作鏡檢觀小時同時作鏡檢觀其能否為純培育其能否為純培育n變形桿菌含有尿素酶，經(jīng)變形桿菌含有尿素酶，經(jīng)2424小時培育能分解培小時培育能分解培育基中較多量尿素產(chǎn)生大量的

16、氨，使培育基育基中較多量尿素產(chǎn)生大量的氨，使培育基PHPH變變?yōu)辂|性，而呈現(xiàn)紅色。即陽性反響，陽性反響可為鹼性，而呈現(xiàn)紅色。即陽性反響，陽性反響可棄之。棄之。痢疾桿菌屬及沙門氏菌屬之細菌不能分解尿素而痢疾桿菌屬及沙門氏菌屬之細菌不能分解尿素而不呈現(xiàn)堿性反響即陰性反響，陰性反響不呈現(xiàn)堿性反響即陰性反響，陰性反響 需繼續(xù)作需繼續(xù)作生化反響及血清學實驗。生化反響及血清學實驗。生化反響管原理生化反響管原理2 2n糖發(fā)酵實驗，細菌具有多種酶系統(tǒng)能分解糖類，產(chǎn)糖發(fā)酵實驗，細菌具有多種酶系統(tǒng)能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不同的細菌對各種糖類的分解不同，因此酸產(chǎn)氣。不同的細菌對各種糖類的分解不同，因此可以利用糖發(fā)酵進

17、展各種細菌可以利用糖發(fā)酵進展各種細菌( (特別是腸道細菌特別是腸道細菌) )的的鑒別。鑒別。n大腸桿菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。n志賀痢疾桿菌、沙門氏菌、變形桿菌不分解乳糖，志賀痢疾桿菌、沙門氏菌、變形桿菌不分解乳糖，但能分解葡萄糖產(chǎn)酸。但能分解葡萄糖產(chǎn)酸。n宋內(nèi)氏痢疾桿菌緩慢發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，能分解葡萄糖宋內(nèi)氏痢疾桿菌緩慢發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，能分解葡萄糖產(chǎn)酸。產(chǎn)酸。生化反響管原理生化反響管原理3 3n硫化氫實驗：某些細菌能分解培育基中硫氨基硫化氫實驗：某些細菌能分解培育基中硫氨基酸如胱胺酸產(chǎn)生硫化氫、硫化氫與硫酸亞酸如胱胺酸產(chǎn)生硫化氫、硫化氫與硫酸亞鐵中的亞鐵離子結(jié)合構(gòu)成黑色的硫化鐵，鐵中的亞鐵離子結(jié)合構(gòu)成黑色的硫化鐵，n變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能產(chǎn)生硫化鐵變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能產(chǎn)生硫化鐵n痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化鐵。痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化鐵。 方法：方法：n1 1、克氏雙糖鐵斜面培育基：分別取四種腸道桿菌、克氏雙糖鐵斜面培育基：分別取四種腸道桿菌的培育物，用穿刺加斜面劃線接種方法接種于的培育物，用穿刺加斜面劃線接種方法接種于4 4支支克氏雙糖斜面培育基，克氏雙糖斜面培育基，3737培育培育18-24h18-24h以后察看以后察看結(jié)果。結(jié)果。n2 2、生化反響管：取