1、什么(shn me)是高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography 高效液相色譜法，簡稱：HPLC 是一種基于儀器方法的高效能分離(fnl)手段： 高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器 廣泛應用于各個領域： 醫藥 / 環保 / 石化 / 生命科學 / 食品及農業 在技術，理論及應用上仍處于發展階段第1頁/共42頁第一頁，共43頁。 定量分析主要(zhyo)基于與標準品的比較 是其最大應用領域 定性分析；不是色譜的強項 基于樣品的保留時間比較 借助于和其聯用的紫外、質譜或其他檢測器 對定量及定性分析的要求 靈敏度、精度及準確度

2、的要求 樣品量的要求；復雜樣品的分析能力 容易使用什么(shn me)是高效液相色譜法第2頁/共42頁第二頁，共43頁。高效液相色譜如何(rh)工作一個儲液瓶裝有溶劑稱為流動相，因為溶劑是流動的。一個高壓泵溶劑傳輸系統或稱溶劑管理器用來產生和計量流動相的流速，一般是毫升/分鐘。一個進樣器樣品管理器或自動進樣器可以將樣品導入注射連續的流動相 ，并由流動相攜帶樣品進入高效液相色譜柱。色譜柱裝有能獲得分離效果(xiogu)的填料。這種填料稱為固定相因為它被柱硬件包圍住。檢測器用來查看化合物流出色譜柱時被分開的譜帶大多數化合物沒有顏色，所以人眼觀察不到。流動相流出檢測器可被送至廢液瓶，或按需被收集。當

3、流動相含有一個分開的化合物譜帶，高效液相色譜可以收集含有純化的化合物的該洗脫組分，用于進一步分析。注意高壓管路和附件用來連接泵、進樣器、色譜柱和檢測器單元，形成流動相、樣品和化合物分離譜帶的通路。第3頁/共42頁第三頁，共43頁。 檢測器連接計算機數據站，高效液相色譜系統單元先記錄電信號，再將電信號轉換為色譜圖，在顯示屏上展現出來。 定性和定量樣品內溶物濃度。 由于樣品中化合物性質差異很大，幾種類型的檢測器被開發出來。 如果一個化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收檢測器。 如果這個化合物發熒光，可使用熒光檢測器。 如果該化合物沒有上述性質之一，可使用更廣泛的檢測器，如蒸發光散射檢測器ELSD。

4、最強大的方式是順序使用多個檢測器。例如，紫外和/或蒸發光檢測器可和質譜儀MS聯用來分析色譜分離的組分。這樣，從一次進樣，可得到(d do)分析物的更多綜合的信息。將質譜與高效液相色譜系統耦合稱之為液質聯用. 高效液相色譜(s p)如何工作第4頁/共42頁第四頁，共43頁。流動(lidng)相 泵色譜(s p)柱檢測器 泵輸液分離 檢測 記錄AEGBCDF進樣閥進樣第5頁/共42頁第五頁，共43頁。液相色譜(s p)的各部分示意圖 液相色譜實驗所需的基本參數-亦稱色譜條件 流動相：種類及配比，等度或梯度 固定相：色譜柱類型及內徑、長短(chngdun) 流動相輸送系統參數：流速 檢測器參數：紫外

5、檢測波長，靈敏度等 溫度控制 進樣量第6頁/共42頁第六頁，共43頁。 儀器組成及開機 溶劑管理系統的準備 樣品管理系統的準備 運行樣品 數據采集 報告(bogo)打印 關機 Waters e2695 型高效(o xio)液相色譜儀操作方法 第7頁/共42頁第七頁，共43頁。Waters e2695 型高效(o xio)液相色譜儀操作方法 儀器(yq)組成及開機 1 儀器(yq)組成 Waters e2695 分離單元 2498型紫外檢測器 色譜管理工作站 打印機 四元梯度(t d)洗脫的溶劑輸送系統四通道在線真空脫氣機可容納 120 個樣品瓶的自動進樣系統柱溫箱內置的柱塞桿密封墊清洗系統溶劑

6、瓶托盤液晶顯示器鍵盤用戶界面及軟盤驅動器第8頁/共42頁第八頁，共43頁。 2 開機(ki j) 打開電源至on位置，開機依次接通 2695 分離單元、檢測器、計算機和打印機的電源。接通后，約 20s 儀器(yq)開始自檢，約 1min 后，顯示主屏幕，此時繼續各部件的初始化。 第9頁/共42頁第九頁，共43頁。溶劑(rngj)管理系統的準備 流動相脫氣確認所有溶劑管路都充滿溶劑，按【 Menu/Status 】，進入(jnr)“ Status （ 1 ）”屏幕第10頁/共42頁第十頁，共43頁。溶劑(rngj)管理系統的準備第11頁/共42頁第十一頁，共43頁。必須用色譜純有機溶劑，水或緩沖

7、鹽要用超純水；水相流動相需要每48h重新配制，特別是100%含水流動相；檢查(jinch)6根管子是否均在液面下，必須保證6根管子全部插到溶劑瓶底部。第12頁/共42頁第十二頁，共43頁。打開(d ki)真空脫氣機（degasser）第13頁/共42頁第十三頁，共43頁。Wet prime（執行(zhxng)濕灌注）第14頁/共42頁第十四頁，共43頁。流動(lidng)相平衡色譜柱同理溫度、流速(li s)都可在此控制面板設定！第15頁/共42頁第十五頁，共43頁。流動(lidng)相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）

8、親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型(lixng)分離柱上的出峰順序相反。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇(ji chn) 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環己烷己烷煤油(最小)第16頁/共42頁第十六頁，共43頁。流動(lidng)相方面要求 除去微粒 純度的要求 超純水，梯度實驗(shyn)時水中有機雜質含量要低（建議走空白檢驗）

9、 緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內 緩沖液（鹽）的濃度 溶劑：色譜純，并與填料相匹配 溶劑中的雜質含量 注意溶劑的相容性，避免使用不相容的溶劑 流動相對樣品的溶解度 有機溶劑或水的比例第17頁/共42頁第十七頁，共43頁。 流動相的轉換要緩慢 流速(壓力)的變化幅度較小，比較穩定 溫度的變化幅度 專用色譜(s p)柱樣品及溶劑的要求色譜柱的使用(shyng)及操作第18頁/共42頁第十八頁，共43頁。 裝載樣品盤（loading carousels）： 裝入樣品與轉盤將樣品瓶插到樣品盤合適的位置，打開樣品倉門，顯示“ Door is Open ”屏幕(pngm)，裝入樣品盤，按【 Next

10、】，直至所有樣品盤裝畢，關倉門。 樣品(yngpn)管理系統的準備第19頁/共42頁第十九頁，共43頁。樣品(yngpn)方面要求 溶劑和樣品過濾非常重要，它會對色譜柱、儀器(yq)起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響。 色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細管容易堵塞。 儀器(yq)：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。 除去微粒及雜質 了解樣品在流動相中的溶解度,如樣品的溶劑不是流動相，一定要確保樣品在流動相中不析出。 了解樣品與色譜柱的基質/填料是否相互作用。第20頁/共42頁第二十

11、頁，共43頁。運行(ynxng)樣品 配置系統項目 管理數據（相當于新建文件夾），鼠標右鍵選新建，設定項目名（設定后將出現在運行樣品中）。 建立方法組并運行樣品 在瀏覽項目中打開你的項目，通過“新建儀器方法”來設定使用的儀器方法（即對配置系統一步選定的主機和檢測器進行參數設置）：儀器方法（新建儀器方法，包括主機和選定的檢測器的參數的設置設置好選另存為保存(bocn)此儀器方法關閉）此時上述編輯的儀器方法出現在列表中第21頁/共42頁第二十一頁，共43頁。第22頁/共42頁第二十二頁，共43頁。運行(ynxng)樣品第23頁/共42頁第二十三頁，共43頁。 在瀏覽項目中打開你的項目，通過“新建方

12、法組”來設定具體儀器方法、處理(chl)方法、報告方法另存為“方法組”，設置方法名（與剛才的儀器方法名相統一）完成。第24頁/共42頁第二十四頁，共43頁。在“運行樣品”中打開(d ki)設定的儀器方法，并在設針時選定設定的方法組來對樣品進行分析。第25頁/共42頁第二十五頁，共43頁。數據處理都可以在“瀏覽項目”中完成。點開“瀏覽項目”，選定要要瀏覽的項目，確定后進入的界面中有如下內容(nirng)：樣品組、進樣、通道、方法、結果組、結果等。第26頁/共42頁第二十六頁，共43頁。PDA數據處理在瀏覽項目中，點“通道”雙擊要處理的原始數據（點查看圖標）進入查看主窗口提取色譜圖點“處理方法向導

13、”圖標新建處理方法峰1、峰2積分區域（選定要積分的峰）給出條件剔除(tch)不要的峰純度匹配PDA光譜對照處理方法名完成（然后又出現主窗口，處理結果自動給出）點“方法組”圖標，選好后點“文件”下的“另存為”“方法組”，設定即可。至此選好處理方法。結果處理：選好數據，右鍵選處理選好方法組（上面設定好的）點結果即可給出處理好的數據注：通道無論什么時候給出的都是未處理數據。第27頁/共42頁第二十七頁，共43頁。第28頁/共42頁第二十八頁，共43頁。第29頁/共42頁第二十九頁，共43頁。 FD數據處理： 點“處理方法向導”圖標新建處理方法在新方法（方法類型中選LC）新建處理方法峰1、峰2積分區域

14、（選定要積分的峰）給出條件剔除不要的峰處理方法名完成（然后又出現主窗口，處理結果自動(zdng)給出） 至此選好處理方法。第30頁/共42頁第三十頁，共43頁。色譜圖：HPLC圖形(txng)結果（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過(tnggu)檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間。 色譜(s p)峰保留時間（分）基線峰高峰寬響應值第31頁/共42頁第三十一頁，共43頁。色譜(s p)圖 參數基本概念 色譜峰 Peak 色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號的微分曲線 峰底 Peak Base 峰的起點與終點(zhngdin)之間連接的

15、直線 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距離 峰寬 Peak Width 在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離 半（高）峰寬 Peak Width at Half Height 通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離第32頁/共42頁第三十二頁，共43頁。 峰面積 Peak Area 峰與峰底之間的面積,又稱響應值 標準偏差； Standard Error 0.607倍峰高處所對應(duyng)峰寬的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿較前沿平緩的不對稱峰 前伸峰 Leading Peak 前沿較后沿平緩的不對稱峰 鬼峰 Ghost Pea

16、k 并非由試樣所產生的峰；亦稱假峰色譜(s p)圖 參數基本概念第33頁/共42頁第三十三頁，共43頁。 基線 Baseline 在正常操作條件下，僅由流動相所產生(chnshng)的響應信號的曲線 基線飄移 Baseline Drift 基線隨時間定向的緩慢變化 基線噪聲；N Baseline Noise 由各種因素所引起的基線波動 譜帶擴展 Band Broadening 由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現象色譜(s p)圖 參數基本概念第34頁/共42頁第三十四頁，共43頁。 死時間，t0 Dead time 不被固定相滯留的組分，從進樣到出現

17、(chxin)峰最大值所需的時間 保留時間，tR Retention time 組分從進樣到出現(chxin)峰最大值所需的時間 死體積，V0 Dead volume 不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(chxin)峰最大值所需的流動相體積 保留體積，VR Retention volume 組分從進樣到出現(chxin)峰最大值所需的流動相體積色譜(s p)圖 參數基本概念第35頁/共42頁第三十五頁，共43頁。 在結果中，選擇圖譜點打印，報告(bogo)打印時，選擇設定好的報告(bogo)模式，或者選擇 “缺醒單個報告(bogo)”模式打印，在待打印的模式下可以編輯報告(bogo)顯示的信息

18、，比如表頭，色譜圖的顯示范圍，表格中所需內容等。報告(bogo)打印第36頁/共42頁第三十六頁，共43頁。第37頁/共42頁第三十七頁，共43頁。第38頁/共42頁第三十八頁，共43頁。關 機 數據采集完畢后，關閉(gunb)檢測器電源開關，以節省使用壽命。 使用完畢，按規定用適當的溶劑沖洗色譜柱、系統管路、自動進樣器、進樣針和柱塞桿密封墊，確保 2695 分離單元已徹底沖洗干凈后，關閉(gunb)電源開關。 處理數據并打印報告后，關閉(gunb)計算機和打印機電源開關，并做使用登記。 第39頁/共42頁第三十九頁，共43頁。HPLC使用(shyng)常見注意事項 1.夏季氣溫高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必須每天都要更新。 2.柱壓變動范圍較大，處理方法：多為進氣泡。高低流速交替沖洗。 3. 配制的流動