1、大腸桿菌紫外線誘變及抗藥性菌株篩選0740063阿膺蘭1. 前言抗生素能破壞細菌細胞壁的結構，使細菌的繁殖和生長受到抑制。但某些細菌對抗生素表現出抗性，原因是其基因發生了改變，產生能抵抗抗生素的性狀。在自然情況下，細菌的基因突變率很低，而且突變是不定向的，因此在自然條件下，想要獲得有抗性的細菌是很困難的。當給與適當的物理條件時，其突變率會大大增加。如當用a射線、3射線、丫射線、X射線、中子和其他粒子、紫外線、微波等物理因素輻射時，能夠促進遺傳物質突變。DNA對紫外線(UV)有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嚅嚏，它比喋吟更為敏感。紫外線引 起DNA結構變化的形式有 DNA鏈斷裂、堿基破壞、胸腺嚅

2、嚏二聚體等。因此，紫外線通常作為誘變劑，用于微生物菌種選育。一般細胞分裂越旺盛，誘變劑量越大，突變率高，誘變最有效的波長 253265 nm。選擇合適的誘變劑量對于獲得較高突變率十分關鍵，過高 或過低的輻射劑量會導致菌株死亡或誘變不充分而降低誘變效果。在紫外線誘變下，菌株發生不定向的突變，想要得到需要的特向變異必須對誘變后的菌 株做篩選。本實驗想要得到的是能夠抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培養基作為篩選培養基對菌種進行篩選。若菌株沒有發生定向突變，則該菌株不能在抗性培養基上正常生長， 只有發生了定向突變才可能在篩選培養基上正常生長。紫外線對于菌株有誘變作用外，對菌株還有較強的致死作用，因為

3、紫外線改變了菌株的 基因結構導致菌株無法正常生長繁殖。因此，通過本實驗的操作， 在合適的照射劑量的設置下，比較不同不同照射劑量下的致死效果和突變率，并初步分析兩者的相關性。在分析死亡曲線和誘變率曲線的基礎上，能了解誘變育種的機理和方法，為做進一步的誘變實驗做準備。2. 材料和方法2.1實驗材料、儀器和試劑 菌種：大腸桿菌 儀器：超凈臺、離心機、高壓滅菌鍋、培養箱、磁力攪拌器、培養皿、涂布器、移液管、移 液器 試劑：牛肉膏蛋白月東培養基相關試劑、硫酸卡那霉素水溶液( 50mg/ml)、生理鹽水 2.2實驗方法 2.2.1制備培養基 普通培養基牛肉膏蛋白月東培養基(400ml)：牛肉膏5g 蛋白月

4、東10g Nacl 5g 瓊脂20g 蒸儲水1000mlPh7.0按配方配制好培養基后置于滅菌鍋中115C 15min，倒平板，4皿*15ml*5組+2皿*15ml=22皿 *15ml=330ml 篩選培養基(200ml):含抗生素 50mg/L。(卡那霉素屬于氨基糖昔類抗生素，能結合細菌核 糖體的30S亞基上的16SrRNA，阻斷細菌蛋白質的合成。) 牛肉膏5g 蛋白月東10g Nacl 5g 瓊脂20g 蒸儲水1000ml Ph7.0 硫酸卡那霉素 水溶液(50mg/ml) 0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115C 15min滅菌，取出培養基后冷卻至 60C時將硫酸卡那霉素

5、0.2ml加入培養基中，充分震蕩混勻，倒平板，2皿*15ml*5 組 +2 皿 *15ml=12 皿*15ml=180ml 2.2.2制備菌懸液(106 108個/mL) 固體培養：大腸桿菌劃線或涂布接種于固體培養基，37C培養24-48h。 菌懸液：用適量生理鹽水刮洗菌落，倒入一個無菌小三角瓶(或試管)中，充分振蕩使菌體散開，得到菌懸液。 菌懸液濃度用血球計數板計數使用細菌計數板或血球計數板在顯微鏡下直接計數。將菌液滴在血球計數板 0. 1ml的計數格中，細菌被固定染色后，在顯微鏡下選擇數出若干個小格中的細菌數目，（一般數125個小格），根據比例關系折算出單位體積菌液中細菌的數量。血球計數板

6、規格：計數格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格小格體積=0.05*0.05*0.1=0.00025mm 3=2.5*10-7ml（長* 寬*高）計算方法例如：125格中90個細菌，貝U （ 90+ 125） + （ 2.5*10-7）個/ml=2.88*10 6所以，125格中的細菌大約在 31（4格1個菌）一3125（每個小格25個菌）個。2.2.3誘變處理及接種 將紫外燈打開，預熱 30min ; 取無菌培養皿（90mm，含無菌大針），加入稀釋好的菌懸液8ml以覆蓋培養皿底面為宜。 將待處理的培養皿置于誘變箱內的磁力攪拌儀上，開啟磁力攪拌儀旋紐進行攪拌1分鐘，然后打開皿蓋，分別處理

7、10s、20s、40s、80s、160s （可以累積照射），照射完畢后先蓋上皿蓋，再關閉攪拌和紫外燈； 每個照射劑量分別取 0.5ml分別稀釋1000倍和100倍，然后取稀釋液 0.1ml做普通培養基的涂布培養，每個處理兩個重復；同時每個照射劑量取0.1ml照射液直接做兩個篩選培養基的涂布培養。 對照涂布培養：將照射的菌液稀釋1000倍，在稀釋液中取0.1ml做2個普通培 養基涂布培養,2個篩選培養基的涂布培養。涂布要均勻，培養基表面無液流。 37C培養24h后，計數，統計分析。對于篩選的抗性菌種進行驗證、純化。2.2.4.結果計數、分析、統計及討論 以輻射時間為橫坐標，以存活菌落數的lg值為

8、縱坐標，作紫外線對大腸桿菌致死效應曲線。 列公式計算不同輻射劑量下的致死率。死亡率=照射前活菌數、/l射后活菌數/ml100% 計算并比較不同輻射劑量下大腸管桿菌的抗藥突變率，并分析不同輻射劑量的誘變效果差異原因突變率=篩選平板菌數/普通平板菌數*100% 抗藥性菌株的篩選與純化將一抗性克隆劃線到一新的抗性平板上，與對照菌相比較，觀察生長狀況3. 結果與分析3.1實驗結果記錄及初步整理表1.大腸桿菌誘變初始數據照射時間篩選培養基活菌數普通培喬卜 稀釋度普通培養基中菌數溶液濃度個/ml1號個/皿2號 平均1號個/皿2號平均00001005000560053005.3*10 700010-2200

9、0182018201.8*1061000010-336625125162.5*1000010-2256444.54.5*1042000010-32014 1*1000010-22533.5*10 34000010-3000000010-2502.532.5*108000010-3400202*10 500010-2000016000010-300003.2最佳照射時間的設置結合數據處理結果的圖和表分析，在10s的照射下，細菌死亡率達到了95%, 20s時達到了99.9%，說明在20s內大部分菌株已經死亡，而整個實驗過程中未發生任何正突變，可能與 此有較大關系。已經有實驗證實，當菌種死亡率達到7

10、0%80%時，突變率最大。所以在做進一步的實驗中應該減少照射劑量，或通過增多10s內的照射設置，或增大照射距離，因為時間太短可能導致控制實驗的難度加大。使死亡率變化曲線能突顯出變化趨勢。3.3篩選培養基選擇該實驗中的篩選培養基但這抗性也是有一定范50mg/L,實驗證明該篩選培養基是將發生突變的菌株從普通菌株中顯現出來并對其濃縮。中的添加劑是硫酸卡那霉素，若發生突變的菌株能對其顯現出抗性，圍的，若超過其抗性范圍即使發生突變也不能正常生長。本實驗選用的濃度對于該菌種抗性選育來說已經過高，應該選擇較低的濃度。可以在試驗前對該菌種的最低致死濃度做檢測。將制備好的出發菌株溶液涂布在含不同濃度硫酸卡那霉素

11、的平板上37 C培養24h,觀察不同平板上的菌落數，并記錄不同抗生素作用濃度。凡是在前一個低濃度平板上已長出菌落而在后一個較高濃度平板上未長出菌落的，后一濃度即為某種抗生素對出發菌株的最低致死濃度【1】。表2.不同照射劑量下的存活率lg值和死亡率照射時間/s存活菌濃度存活菌的lg值死亡菌濃度致死率 05.3*10 77.7200102.5*10 66.405.05*1070.9532044.5*104.655.29*1070.999403.5*10 33.545.299*10 70.9999802.5*10 33.395.299*10 70.999916005.3*1071存活曲線 80100150200照射時間照射時間4. 小結與討論(1) 本實驗通過對大腸桿菌進行紫外線照射，欲得到抗性菌株，但由于照射劑量過大 和抗生素濃度過高等原因未得到任何一株抗性菌株。(2) 通過本實驗，得到了在28cm ,下大腸桿菌的照射致死致死曲線，可以依此曲線反 回歸在該照射條件下選擇合適的照射時間得到較高的突變率。(3) 欲得到較高的抗性突變率，還可嘗試改變培養溫度，有實驗證實不同的溫度培養 會對細菌的突變率造成影響【2】。(4) 欲得到較好的突變率還需要較優質的菌株。因為菌株的突變主要是發生在遺傳物質復制轉錄的過程中，所以菌株的生理活性對突變效率會有很大影響，最好選擇在對數期