1、水中的細菌總數測定 1.培養基的配制2.消毒與滅菌3.水中細菌總數的測定4.菌落計數法（一）實驗目的（一）實驗目的（二）實驗原理（二）實驗原理（三）實驗器材（三）實驗器材（四）實驗方法（四）實驗方法（五）實驗作業（五）實驗作業（一）實驗目的（一）實驗目的1 1、明確培養基的配制原則；、明確培養基的配制原則；2 2、掌握配制培養基的一般方法和步驟；、掌握配制培養基的一般方法和步驟；3 3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；4 4、掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用滅菌、掌握高壓蒸汽滅菌技術，了解幾種常用滅菌方法。方法。（二）實驗原理（二）實驗原理 培養

2、基培養基是按照微生物生長繁殖或積累代謝產物是按照微生物生長繁殖或積累代謝產物所需的各種營養物質，用人工方法配制而成的一所需的各種營養物質，用人工方法配制而成的一種基質。它包括碳源、氮源、能源、生長因子、種基質。它包括碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水六類營養要素。由于不同微生物細胞無機鹽和水六類營養要素。由于不同微生物細胞組成不同，因而所需營養基質不同，為了分離、組成不同，因而所需營養基質不同，為了分離、培養和鑒定不同的微生物，必須根據其需要，配培養和鑒定不同的微生物，必須根據其需要，配制合適的培養基制合適的培養基. . 培養基的種類繁多，根據培養基的成分、物培養基的種類繁多，根據培養基的

3、成分、物理性狀不同，可分為天然培養基、合成培養基、理性狀不同，可分為天然培養基、合成培養基、半合成培養基、固體培養基、半固體培養基和液半合成培養基、固體培養基、半固體培養基和液體培養基。體培養基。常用加熱滅菌法常用加熱滅菌法：1 1、干熱滅菌：、干熱滅菌： 用火焰燒灼或電熱干燥箱內高溫熱空氣滅菌用火焰燒灼或電熱干燥箱內高溫熱空氣滅菌2 2、濕熱滅菌、濕熱滅菌 高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法 間歇滅菌法間歇滅菌法 煮沸消毒法煮沸消毒法 滅菌滅菌是指應用物理或化學的方法，殺滅物是指應用物理或化學的方法，殺滅物體表面和內部一切微生物營養體、芽孢和孢體表面和內部一切微生物營養體、芽孢和孢子。滅菌方法很多

4、，可分為加熱、過濾、照子。滅菌方法很多，可分為加熱、過濾、照射和化學藥品法等。射和化學藥品法等。（三）實驗器材（三）實驗器材1.藥品和試劑：藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaClNaCl、1010NaOHNaOH溶液、溶液、1010鹽酸溶液。鹽酸溶液。2.器材：器材：天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、 PHPH試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。1.1.稱量稱量按照培養基配方，準確稱量各成份放于瓷缸中。按照培養基配方，準確稱量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏

5、配方：牛肉膏5.0g,5.0g,蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，NaCl5.0g,NaCl5.0g,瓊脂瓊脂20.0g,20.0g,蒸餾水蒸餾水1000ml,pH7.01000ml,pH7.0。（四）實驗方法（四）實驗方法 培養基的制備過程培養基的制備過程稱量稱量-溶解溶解-調節調節pHpH值值-過濾過濾- -分裝及包扎分裝及包扎-滅菌滅菌-滅菌后試管滅菌后試管擺放斜面擺放斜面2.2.溶解溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使其溶解。如是配制固體培養基，在瓊脂的熔化過其溶解。如是配制固體培養基，在瓊脂的熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使

6、培養基溢程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。 3.3.調節調節pHpH值值用玻璃棒沾少許液體，測量用玻璃棒沾少許液體，測量PHPH值。用氫氧化鈉和值。用氫氧化鈉和鹽酸調節鹽酸調節PHPH。4.4.過濾過濾用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。去。5.5.分裝及包扎分裝及包扎根據不同的需要，可將制好的培養基分裝入試根據不同的需要，可將制好的培養基分裝入試管內（用分裝漏斗）或三角瓶內，管（瓶）口管內（用分裝漏斗）或三角瓶內，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。

7、塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。6.6.滅菌：滅菌：高壓蒸汽滅菌，高壓蒸汽滅菌，1211210 0C C滅菌滅菌2020分鐘。分鐘。7. 滅菌后試管擺放斜面滅菌后試管擺放斜面注注 意意 事事 項項1 1、稱取藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；、稱取藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；2 2、蛋白胨極易吸濕，稱取時動作要迅速；、蛋白胨極易吸濕，稱取時動作要迅速；2 2、配制固體培養基時，先將其他藥品加熱溶解到快沸時，再將稱好、配制固體培養基時，先將其他藥品加熱溶解到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續加熱至瓊脂完全熔化，此過程要不斷攪拌，以免瓊的瓊脂加入，繼續加熱至瓊脂完全熔化，

8、此過程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢；脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢； 4 4、分裝量根據試管大小和實際需要而定，固體培養基裝量約為管高、分裝量根據試管大小和實際需要而定，固體培養基裝量約為管高的的1/51/5，液體培養基的裝量約為管高的，液體培養基的裝量約為管高的1/41/4，三角瓶的裝量不超過瓶體，三角瓶的裝量不超過瓶體的的1/2 1/2 ； 5 5、分裝過程中注意不要將培養基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞、分裝過程中注意不要將培養基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。而引起污染。返返 回回（五）實驗作業（五）實驗作業為什么濕熱滅菌比干熱滅菌法更有效？為什么濕熱

9、滅菌比干熱滅菌法更有效？消毒與滅菌消毒與滅菌 1干熱滅菌法干熱滅菌法 2高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 3紫外線滅菌法紫外線滅菌法（二）（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 1、原理、原理 利用加熱一個密閉的加壓滅菌鍋，使滅菌利用加熱一個密閉的加壓滅菌鍋，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。由于蒸氣不能鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高于增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。質凝固變性而達到滅菌的目的。 一般培養基用一般培養基用0.1Mpa，121.5,1530

10、min 2、步驟、步驟加水加水裝待滅裝待滅菌物品菌物品加蓋加蓋加熱加熱滅菌時間到后滅菌時間到后斷電源斷電源壓力降為零壓力降為零開箱取物開箱取物（三）紫外線滅菌法（三）紫外線滅菌法1 1、原理、原理 紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和腺嘧啶二聚體的形成和DNA DNA 鏈的交聯，從而鏈的交聯，從而抑制了抑制了DNA DNA 的復制。另一方面，由于輻射能的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成使空氣中的氧電離成OO，再使，再使O O2 2 氧化生成氧化生成臭氧或使水氧化生成臭氧或使水氧化生成H H2 2O O2 2。O O3 3 和和H

11、H2 2O O2 2 均有均有殺菌作用。殺菌作用。 適用于無菌室，接種箱，手術室內的空適用于無菌室，接種箱，手術室內的空氣及物體表面的滅菌。氣及物體表面的滅菌。2 2、步驟、步驟 1 1）單用紫外燈）單用紫外燈 在無菌室內或在接種箱內打開紫外線在無菌室內或在接種箱內打開紫外線燈開關，照射燈開關，照射30min30min，將開關關閉。，將開關關閉。 2 2）化學消毒劑與紫外線照射結合使用）化學消毒劑與紫外線照射結合使用 在無菌室內，先噴灑化學消毒劑溶液，在無菌室內，先噴灑化學消毒劑溶液，再用紫外線燈照射再用紫外線燈照射15imn15imn水中細菌總數測定水中細菌總數測定一、水樣的采集一、水樣的采

12、集 1. 采水容器采水容器 采樣瓶：具磨口玻塞的采樣瓶：具磨口玻塞的500mL廣口瓶廣口瓶 采樣瓶的洗滌采樣瓶的洗滌 采樣瓶的滅菌采樣瓶的滅菌: 160170干熱滅菌干熱滅菌2h，或用高壓蒸汽，或用高壓蒸汽滅菌器，滅菌器，121滅菌滅菌15min一、水樣的采集一、水樣的采集2. 采樣步驟及注意事項采樣步驟及注意事項 (1)去氯和高濃度重金屬：滅菌前按去氯和高濃度重金屬：滅菌前按500mL采樣瓶加入采樣瓶加入0.3mL10%Na2S2O3溶液溶液 (2) 采集江、河、湖、庫等地表水樣時，可握住瓶子下部直接采集江、河、湖、庫等地表水樣時，可握住瓶子下部直接將已滅菌的帶塞采樣瓶插入水中，約距水面將已

13、滅菌的帶塞采樣瓶插入水中，約距水面1015cm處采集處采集 （3）采集一定深度的水樣時，可使用單層采水器或深層采水器）采集一定深度的水樣時，可使用單層采水器或深層采水器 （4）從自來水龍頭采集樣品時，采水前可先將水龍頭打開至最）從自來水龍頭采集樣品時，采水前可先將水龍頭打開至最大，放水大，放水35min，用酒精燈火焰灼燒約，用酒精燈火焰灼燒約3min滅菌滅菌 （5）在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免）在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免不同層次的攪擾；同一采樣點與理化監測項目同時采樣時，應不同層次的攪擾；同一采樣點與理化監測項目同時采樣時，應先采集細菌學檢驗樣品先采集

14、細菌學檢驗樣品 （6）采樣完畢，做好記錄）采樣完畢，做好記錄 二、樣品保存二、樣品保存 采好的水樣，應迅速運往實驗室，進行細菌學采好的水樣，應迅速運往實驗室，進行細菌學檢驗。一般從取樣到檢驗不宜超過檢驗。一般從取樣到檢驗不宜超過2h，否則應，否則應使用使用10以下的冷藏設備保存樣品，但不得超以下的冷藏設備保存樣品，但不得超過過6h 細菌總數的測定 細菌總數：指細菌總數：指lmL水樣在營養瓊脂培養基中，于水樣在營養瓊脂培養基中，于37培養培養24h后，所生長細菌菌落的總數后，所生長細菌菌落的總數。 一、細菌總數測定的意義一、細菌總數測定的意義 可以反映水體有機污染的程度可以反映水體有機污染的程度 生活飲用水的細菌總數生活飲用水的細菌總數lmL不得超過不得超過100個個 細菌總數的測定二、培養基的制作二、培養基的制作 三、測定方法及步驟三、測定方法及步驟 1.稀釋水樣稀釋水樣2.接種水樣接種水樣3.培養：培養：37下倒置培養下倒置培養24h24h 細菌總數的測定水樣225mL無菌水25mL1mL1mLckck10-110-110-210-210-310-31mL1mL1mL1mL1mL1mL三、菌落計數三、菌落計數 3724h 細菌總數的測定例次不同稀釋度的平均菌落數兩個稀釋度菌落數之比菌落總