1、1會(huì)計(jì)學(xué)B遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)徐晉麟分子生物遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)徐晉麟分子生物學(xué)學(xué)螺旋槳效應(yīng)DNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 一一DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素 (1)堿基對(duì)之間的氫鍵。 (2)堿基的堆集力。 它包括： 疏水作用； 范德華力； 磷酸基的負(fù)電荷斥力；堿基配對(duì)及氫鍵形成堿基配對(duì)及氫鍵形成 水解 磷酸基團(tuán) 脫氧核糖(DNA 中) 核酸 單核苷酸 戊核糖 核糖 (RNA 中) 核苷 T A DNA 中 堿基 G C RNA 中 U 圖9-7 核糖和脫氧核糖的結(jié)構(gòu)。RNA 和DNA 的 核糖脫氧核戊糖其差異 在于第二個(gè)碳原子上的基 團(tuán)，前者是羥基，后者是氫原子腺苷腺苷(AR)

2、脫氧胞苷脫氧胞苷(dCR)1,N9-糖苷鍵糖苷鍵 1,N1-糖苷鍵糖苷鍵11N9N1C2C4二二. 雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變異雙螺旋結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變異DNA的構(gòu)象現(xiàn)已知有A，B，C，D，E，T，Z 7種。 引起DNA雙鏈構(gòu)象改變有以下因素：（1）核苷酸順序；（2）堿基組成；（3）鹽的種類；（4）相對(duì)濕度。 存在的條件 溝 型雙螺旋類型每螺旋內(nèi)堿基對(duì) 數(shù)每 對(duì)堿 基的 轉(zhuǎn)角每 堿 基對(duì) 的 間距(A)直徑（nm）相 對(duì)濕度鹽的種類大溝小溝A1134.7(右 旋 )2.562.375%Na+,K+, Cs+窄深寬深B1034.0(右 旋 )3.381.992%Na+低鹽寬中等深窄中等深C9.3338.6(右

3、 旋 )3.321.966%Li+寬中等深窄中等深Z12-30(左 旋 )3.711.843%Na+, Mg+高鹽平 淺窄深三三 左旋左旋DNA（一）Z-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。 (3) G的糖苷鍵呈順式(Syn) ，使G殘基位 于分子表面。（4）分子外形呈波形。 (5) 大溝消失，小溝窄而深。 (6) 每個(gè)螺旋有12bp。 Z-DNA B-DNA 扭轉(zhuǎn)角(torsion angle) ： 在嘌呤核苷酸中指（O4C1N9C4）或(C4N9C1O4) 在嘧啶核苷酸中指（O4C1N1C2）或(C2N1C1O4) X A B X A）B Y Y

4、-60 -60 0 900120-9018090120180-90 C4C2 A B G C O C1 2 O Z O3 C5 O3(1) 高鹽：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L (2) Pu,Py相間排列：（3）在活細(xì)胞中如果m5C,則無(wú)需嘌呤-嘧啶相間排列，在生理鹽水的濃度下可產(chǎn)生Z型。 (4) 在體內(nèi)多胺化合物，如精胺和亞胺及亞精胺和陽(yáng)離子一樣，可和磷酸基因結(jié)合，使B-DNA轉(zhuǎn)變成 Z-DNA。 (5)某些蛋白質(zhì)如Z-DNA結(jié)合蛋白帶有正電荷，可使DNA周圍形成局部的高鹽濃度和微環(huán)境。 (6)負(fù)超螺旋的存在( (三三) )生物學(xué)意義生物學(xué)意義(1) 可能提供某些調(diào)節(jié)蛋

5、白的識(shí)別。嚙齒 類動(dòng)物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；(2)在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生動(dòng)物纖毛蟲，它有大、小兩個(gè)核，大核大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核小核和繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說(shuō)明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄有關(guān)。 ATGTGTGT GCATGCAT GCATGCAT 復(fù)制起始點(diǎn) 72bp 72bp ATGC CGC CGT GCACGTAT 仍有活性 ATGTGTGT GCATGCAT 有活性 ATGAGAGT GCAAGGAT 無(wú)活性 圖 8-16 SV40 增強(qiáng)子中的 Z

6、-DNA 及其突變后的影響 超螺旋超螺旋（Supercoied） 松馳型松馳型DNA （relax form）。超螺旋超螺旋（Supercoied） DNA， 負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋 正超螺旋正超螺旋 檢測(cè)檢測(cè)DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法：三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法： 密度梯度離心 凝膠電泳 電鏡觀察超螺旋的定量描敘超螺旋的定量描敘nWhite方程： L=T+WnL（Linking nnmber）：鏈環(huán)數(shù)鏈環(huán)數(shù)或稱拓?fù)洵h(huán)拓?fù)洵h(huán)繞數(shù)繞數(shù)，指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是(1) L是整數(shù)；(2) 在 cccDNA中任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值 保持不變；(3) 右手螺旋對(duì)L取正值。nW（Writhing numb

7、er）：扭曲數(shù)扭曲數(shù)，即超數(shù)旋數(shù)。n其特點(diǎn)是：(1)可以是非整數(shù)；(2)是變量；(3)右手螺旋時(shí)，W取負(fù)值。nT（Twisting number）：纏繞數(shù)纏繞數(shù)，即雙螺旋的圈數(shù)。n其特點(diǎn)是： (1) 可以是非整數(shù)； (2) 是變量； (3) 右手螺旋時(shí)T為正值。H|DNA鳥嘌呤四聚體表 9-2 不同類型 DNA 的三級(jí)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)類 型形態(tài)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)沉 淀 系數(shù)電泳遷移率閉合環(huán)超螺旋1.41最快閉合環(huán)松弛形1.41最慢開環(huán)松弛形1.14同型線形松弛形1.00中等速度DNA的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性變性變性（denaturation）或解鏈解鏈（melting復(fù)性復(fù)性（renaturation）或退火

8、退火（annealing）成核作用成核作用（nucleation）拉拉鏈作用拉拉鏈作用（Zippering）DNA的復(fù)性對(duì)片段有兩個(gè)要求： (1) 互補(bǔ)順序的碰撞和排列； (2) 堿基的正確配對(duì)和氫鍵的形成。下列因素可導(dǎo)致DNA變性：n高溫、n酸、n堿、n尿素、n甲酰胺DNA變性后物理性質(zhì)發(fā)生的變化：（1）流體力學(xué)的性質(zhì)發(fā)生改變：粘度下 降，而沉降速度增加；（2）提高了對(duì)紫外線的吸收能力，此稱為 增色效應(yīng)增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。n雙鏈DNA的A260=1.00（濃度為50g/ml時(shí)，對(duì)波長(zhǎng)260nm紫外線的吸收能力）；n單鏈DNA的A260=1.37；n游離堿基或核

9、苷酸的A260=1.60。n解鏈溫度解鏈溫度（melting temperature, Tm）或熔點(diǎn)，Tm是A260的升高達(dá)到極大值一半時(shí)的溫度。即是變性溫度范圍的中點(diǎn)。n影響變性的因素： 外部條件如溫度和正離子的濃度。 濃度低于0.4mol/L，單價(jià)陽(yáng)離子增高10倍， T m增加16.6 內(nèi)部條件 GC含量及分子類型 當(dāng)GC的含量上升1%，則Tm上升0.4 馬默多蒂馬默多蒂（Marmur-Doty）關(guān)系式關(guān)系式： 復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式 C 1 1 C0 2 1+KC0t1/2 根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)公式我們可以知到些什么？復(fù)性進(jìn)行一半時(shí) = = (1) 單鏈濃度隨著時(shí)間的增大而減小；(2）反

10、應(yīng)速率取決于初始的單鏈濃度Co；(3) 以反應(yīng)濃度和COt1/2為座標(biāo)可繪復(fù)性曲線；(4) 通過(guò)COt1/2值可測(cè)原核生物基因組的大小； 已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec COt1/2 （任何基因組DNA）/9M.sec = 任何基因組大小/4.2X106bp(5)原核生物基因組大小不同，復(fù)性曲線也不同；(6) 可用以區(qū)分真核生物和原核生物基因組。 單一順序和重復(fù)順序單一順序和重復(fù)順序 復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線的區(qū)別復(fù)性動(dòng)力學(xué)曲線的區(qū)別n真核生物的DNA有重復(fù)順序，而原核 生物多為單一順序。(1) 單一順序的復(fù)性曲線常只有一個(gè)拐點(diǎn)， 而重復(fù)順序常有多個(gè)拐點(diǎn)。(2

11、) COt 比值變化范圍。 原核生物的COt比值為100, 真核生物的COt比值大于100 影響復(fù)性反應(yīng)的因素影響復(fù)性反應(yīng)的因素(1) DNA片段的大小；(2) DNA的濃度；(3) DNA復(fù)雜性;(4) 溫度。 最佳復(fù)性溫度一般比Tm低25C。(5) 鹽的濃度： 復(fù)性時(shí)要求鹽的濃度達(dá)到足夠高;為什么？在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過(guò)哪些法來(lái)檢測(cè)？(1) 減色效應(yīng)（hpochromic effcef） 測(cè)定光密度，即OD值值（optical density），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2) 羥基磷灰石柱層析 羥基

12、磷灰石對(duì)雙鏈DNA吸附較牢，不易 吸附單鏈分子雜交分子雜交 分子雜交（molecular hybridization）共同特點(diǎn)是： (1)都是應(yīng)用復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理； (2)都必須有探針探針（probe）的存在。探針就是用同位素或非同位素如熒光染料，生物素等標(biāo)記的短片段特異DNA或RNA順序。 常用的分子雜交方法常用的分子雜交方法n一一. 原位分子雜交（原位分子雜交（in situ hybridization）n二. 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交（dot blotting）n三三. 薩瑟雜交薩瑟雜交（ Southern blot）n四四. 諾瑟雜交（諾瑟雜交（Northern hybridization）n五

13、五. Western blottingn六六. 電鏡觀察電鏡觀察n (1) 異源雙鏈定位法異源雙鏈定位法（Heferoduplex mapping）n (2) R-環(huán)定位法環(huán)定位法（R-loop mapping） (a) 變性 雜交 變性 (b) DNA 變性 RNA 雜交 R環(huán) 圖 9-25 異源雙鏈定位法(a)和 R 環(huán)作圖(b) Z-DNA B-DNA 扭轉(zhuǎn)角(torsion angle) ： 在嘌呤核苷酸中指（O4C1N9C4）或(C4N9C1O4) 在嘧啶核苷酸中指（O4C1N1C2）或(C2N1C1O4) X A B X A）B Y Y ( (三三) )生物學(xué)意義生物學(xué)意義(1) 可能提供某些調(diào)節(jié)蛋白的識(shí)別。嚙齒 類動(dòng)物病毒的復(fù)制起始部位有d（GC）有交替順序的存在；(2)在SV40的增強(qiáng)子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3)原生動(dòng)物纖毛蟲，它有大、小兩個(gè)核，大核大核有轉(zhuǎn)錄活性，小核小核和繁殖有關(guān)。Z-DNA抗體以螢光標(biāo)記后，顯示僅和大核DNA結(jié)合，而不和小核的DNA結(jié)合，說(shuō)明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和轉(zhuǎn)錄有關(guān)。nT（Twisting