1、一、獲取序列一般自己通過測序得到一段序列（已知或未知的都可以），通過NCBI的BLAST獲取相似性較高的一組序列，下載保存為FASTA格式。用BIOEDIT等軟件編輯序列名稱，注意PHYLIP在DOS下運行，文件名不能超過10位，超過的會自動截留前面10位。二、多序列比對目前一般應用CLASTAL X進行，注意輸出格式選用PHY格式。生成的指導樹文件（DND文件）可以直接用TREEVIEW打開編輯，形式上和最終生成的進化樹類似，但是注意不是真正的進化樹。三、構建進化樹1.N-J法建樹依次應用PHYLIP軟件中的SEQBOOT.EXE、DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE和CONSE

2、NSE.EXE打開。具體步驟如下：（1）打開seqboot.exe輸入文件名：輸入你用CLASTAL X生成的PHY文件（*.phy）。R為bootstrap的次數，一般為1000 （設你輸入的值為M，即下兩步DNADIST.EXE、NEIGHBOR.EXE中的M值也為1000）odd number: (4N+1)(eg: 1、5、9)改好了y得到outfile（在phylip文件夾內）改名為2（2）打開Dnadist.EXE輸入2修改M值，再按D，然后輸入1000（M值）y得到outfile（在phylip文件夾內）改名為3 （3）打開Neighboor.EXE輸入3M=1000（M值）按Y

3、得到outfile和outtree（在phylip文件夾內）改outtree為4，outfile改為402(4)打開consense.exe輸入4y得到outfile和outtree（在phylip文件夾內）Outfile可以改為*.txt文件，用記事本打開閱讀。四、進化樹編輯和閱讀outtree可改為*.tre文件，直接雙擊在treeview里看；也可以不改文件擴展名，直接用treeview、PHYLODRAW、NJPLOT等軟件打開編輯。TREEVIEW可以顯示BOOTSTRAN值，序列較多（60條以上）的時候打開直接顯示有明顯的重疊，可以在打印預覽中顯示，或輸出為EMF WMF圖片文件看

4、，但是序列較多時BOOTSTRAN值的顯示位置比較亂，和序列名稱有重疊。PHYLODRAW的編輯功能較強，可以自由調節X、Y軸的長度。輸出格式為BMP、PS格式。缺點是不能直接顯示BOOTSTRAN值，包括打開TREEVIEW輸出的NEX文件，而且輸出的BMP文件不全，類似截屏文件，我用PHOTOSHOP進行拼接合成，添加BOOTSTRAN值和注解符號等。據說也可以將PS文件用記事本打開，改變其中的字號，然后通過ADOBEDISTRILLOR將PS轉化為PDF，就可以解決問題。如果發現還有重疊，可以再次改變PS文件中的字號大小，直到合適為止。 NJPLOT可以顯示BOOTSTRAN值和分值長度

5、。但是不能調節圖片X、Y軸的長度。建MP,ML樹將Dnadist和Neighboot兩步分別改為Dnapars和Dnaml，其余步驟相同。據說ML法序列較多是非常耗時，我沒有嘗試。因為我的序列較多。也可以用CLASTAL X中的BOOTSTRAN N-J TREE法生成進化樹，TREE菜單輸出格式選項（OUTPUT FORMAT OPTION）中的BOOTSTRAN LABELS ON 選NODE（節點）。在treeview里，選擇tree菜單 ,然后把show internal edge lables 的選項打勾了，直接打開生成的文件bootstrap的值就可以顯示出來。下面介紹幾個軟件的使

6、用。首先是 PHYLIP。其是多個軟件的壓縮包，下載后雙擊則自動解壓。當你解壓后就揮發現PHYLIP 的功能極其強大，主要包括五個方面的功能軟件：i，DNA 和蛋白質序列數據的分析軟件。ii，序列數據轉變成距離數據后，對距離數據分析的軟件。 iii，對基因頻率和連續的元素分析的軟件。iv，把序列的每個堿基/氨基酸獨立看待（堿基/氨基酸只有0和1的狀態時，對序列進行分析的軟件。v，按照 DOLLO 簡約性算法對序列進行分析的軟件。vi，繪制和修改進化樹的軟件。在此，我主要對前兩種功能軟件進行說明。   我們現在有幾個序列如下： Mo3     &

7、#160; ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGCACGGTACCAT Mo5       ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo6       ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo7       ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT

8、Mo8       ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT Mo9       ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo12      ATGTATTTCGTACATTACTG CCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo13      ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCC

9、ACCATGAATATTGTACGGTACCAT 要對這8個序列進行進化樹分析，按照上面的步驟，首先用 CLUSTALX排列序列，輸出格式為 *.PHY。用記事本打開如下圖： 圖中的 8 和 50 分別表示 8 個序列和每個序列有 50 個堿基。然后，打開軟件SEQBOOT，如下圖： 按路徑輸入剛才生成的 *.PHY文件，并在Random number seed (must be odd) ?的下面輸入一個4N+1 的數字后，屏幕顯示如下： 圖中的 D、J、R、I、O、1、2 代表可選擇的選項，鍵入這些字母，程序的條件就會發生改變。D選項無須改變。J 選項有三種條件可以選擇，分別是Bootst

10、rap、Jackknife 和 Permute。文章上面提到用 Bootstraping 法對進化樹進行評估，所謂Bootstraping 法就是從整個序列的堿基（氨基酸）中任意選取一半，剩下的一半序列隨機補齊組成一個新的序列。這樣，一個序列就可以變成了許多序列。一個多序列組也就可以變成許多個多序列組。根據某種算法（最大簡約性法、最大可能性法、除權配對法或鄰位相連法）每個多序列組都可以生成一個進化樹。將生成的許多進化樹進行比較，按照多數規則（majority-rule）我們就會得到一個最“逼真”的進化樹。Jackknife則是另外一種隨機選取序列的方法。它與Bootstrap法的區別是不將剩下

11、的一半序列補齊，只生成一個縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與 Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R 選項讓使用者輸入 republicate 的數目。所謂 republicate 就是用 Bootstrap 法生成的一個多序列組。根據多序列中所含的序列的數目的不同可以選取不同的republicate。當我們設置好條件后，鍵入 Y按回車。得到一個文件outfile  Outfile用記事本打開如下： 這個文件包括了100個republicate。 打開DNAPARS（最大簡約性法）或DNAML（最大可能性法）軟件。將剛才生

12、成的outfile文件更名后輸入。如下圖： 選項O是讓使用者設定一個序列作為outgroup。一般選擇一個親緣關系與所分析序列組很接近的序列作為outgroup（本例子不選outgroup），outgroup 選擇的好壞將直接影響到最后的進化樹的好壞。選項 M 是輸入剛才設置的 republicate 的數目。設置好條件后，鍵入 Y按回車。生成兩個文件outfile和treefile。 Outfile打開如下圖： 該文件包括了227個進化樹。Treefile可以用TREEVIEW 軟件打開同樣包含了這227個進化樹。 打開CONSENSE 軟件，將剛才生成的treefile文件更名后輸入。如下

13、圖： 鍵入 Y 按回車。生成兩個文件 outfile 和 treefile。Treefile 用 TREEVIEW 打開，如下圖： Outfile打開如下圖： 我們看出兩個樹是同樣的。但在 outfile 的樹上的數字表示該枝條的 Bootstrap 支持率（除以100.6）。到現在，8個序列的進化樹分析（最大簡約法）已經完成。   如果要用鄰位相連法對這 8 個序列進行分析的話，也首先執行 SEQBOOT 軟件將這8個序列變成100個republicate。然后，打開DNADIST軟件，把SEQBOOT生成的文件輸入，如下圖： 選項 D 有四種距離模式可以選擇，分別是 K

14、imura 2-parameter、Jin/Nei、Maximum-likelihood 和 Jukes-Cantor。選項 T 一般鍵入一個 15-30 之間的數字。選項M 鍵入100。運行后生成文件如下圖： 這個文件包含了與輸入文件相同的100個republicate，只不過每個 republicate是以兩兩序列的進化距離來表示。文件中的每個republicate都省略了第一排的Mo3 Mo5  Mo6   Mo7   Mo8  Mo9   Mo12   Mo13。以這個輸出文件為輸入文件，執行NEIGHBOR 軟件。如下