1、    益氣養血方對膝骨關節炎模型大鼠血清wnt4和wif1的影響    李翠葳+鄭喜+李兆福+祁燕+萬春平+李小絲+管政【摘 要】目的：探討益氣養血方對膝骨關節炎大鼠血清wnt4、wif1水平及膝關節軟骨組織的影響，揭示其治療骨關節炎的部分機制。方法：將70只sd大鼠隨機分為益氣養血方低、中、高劑量組，陽性對照組，模型對照組，空白對照組及假手術組，每組10只。除空白對照組和假手術組外，其余各組大鼠采用改良hulth法構建膝骨關節炎模型；假手術組僅切開關節囊，不切斷韌帶和半月板。造模成功后，益氣養血方低、中、高劑量組分別予益氣養血方1.89 g·

2、;kg-1·d-1、3.78 g·kg-1·d-1、7.56 g·kg-1·d-1灌胃，陽性對照組給予雙氯芬酸鈉腸溶片混懸液4 mg·kg-1·d-1灌胃，模型對照組、假手術組給予生理鹽水2.5 ml·d-1灌胃，空白對照組不予任何藥物。給藥8周后，腹主動脈取血，檢測血清中wnt4、wif1的含量；取右膝關節，he染色，并進行病理評分。結果：與模型對照組比較，益氣養血方各劑量組及陽性對照組病理評分降低（p < 0.05）；與空白對照組、假手術組比較，模型對照組大鼠血清中wnt4水平升高、wif1水平降低（p

3、< 0.05）；與模型對照組比較，益氣養血方中、高劑量組大鼠血清中wnt4水平降低，wif1水平升高（p < 0.05或p < 0.01）；與陽性對照組比較，益氣養血方中、高劑量對wif1的上調作用更為明顯（p < 0.05）。結論：益氣養血方能延緩骨關節炎軟骨退變，保護關節軟骨，其機制可能與下調wnt4的表達，上調wif1的水平，抑制關節軟骨退變相關。【關鍵詞】 骨關節炎，膝；益氣養血方；軟骨形態；wnt4；wif1【abstract】objective：to investigate the effect of yiqi yangxue fang（益氣養血方）on w

4、nt4 andwif1in serum of rats with knee osteoarthritis，to reveal its mechanism in the treatment of osteoarthritis.methods：seventy sd rats were randomly divided into low，middle and high dose groups of yiqi yangxue fang，a positive control group，a model control group，a blank control group and a sham oper

5、ation group，10 rats in each group.except for the blank control group and the sham operation group，the knee osteoarthritis models were established by modified hulth method in the other groups.only the joint capsule was cut open in the sham operation group，and the ligaments and menisci were not cut of

6、f.after modeling，rats in the low，medium and high dose group were respectively given intragastric administration of 1.89 g·kg-1·d-1，3.78 g·kg-1·d-1 and 7.56 g·kg-1·d-1 of yiqi yangxue fang.the positive control group was given intragastric administration of 4 mg·kg-1

7、·d-1 of diclofenac sodium enteric-coated tablets suspension.the model control group and the sham operation group were given 2.5 ml·d-1 of normalsaline.the blank control group wasn't given any drug.after 8 weeks of administration，the blood of abdominal aorta was collected to detect he c

8、ontents of wnt4 and wif1 in serum.the right knee joint was taken for he staining and pathological score.results：compared with the model group，the pathological scores of each group of yiqi yangxue fang and the positive control group decreased（p < 0.05）.compared with the sham operation group and th

9、e blank control group，the level of wnt4 increased and the level of wif1 decreased in the model control group（p < 0.05）.compared with the model control group，the level of wnt4 could be lowered and the level of wif1 could be increased in the medium and high dose group of yiqi yangxue fang（p < 0.

10、05 or p < 0.01）.compared with the positive control group，the medium and high dose of yiqi yangxue fang are more obviously to up-regulate the level of wif1（p < 0.05）.conclusion：yiqi yangxue fang can delay cartilage degeneration and protect articular cartilage，and its mechanism may be related to

11、 down regulation of wnt4，up regulation of wif1 level and inhibition of articular cartilage degeneration. 【keywords】osteoarthritis，knee；yiqi yangxue fang（益氣養血方）；cartilage morphology；wnt4；wif1骨關節炎（osteoarthritis，oa）是臨床上中老年人常見的一種慢性、進展性關節疾病，多由增齡、肥胖、勞損、創傷、關節先天性異常、關節畸形等因素引起關節軟骨變性、軟骨下骨硬化、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生、骨贅形

12、成，產生無菌炎癥，可侵犯全身多個關節1。臨床上以膝骨關節炎（knee osteoarthritis，koa）多見。最近研究表明，原發性oa在我國40歲以上人群中患病率為46.3%，60歲人群比40歲人群的患病率高出一倍。本病的致殘率可達53%2。wnt/-catenin信號通路是骨代謝調控的重要途徑之一，在骨組織的形成、發育及骨重建過程中起關鍵作用，與oa的發生發展密切相關3-5。中醫學認為，本病是風、寒、濕三氣雜合入侵人體，使氣血凝滯不行，痹阻不通。吳生元6認為，本病以肝脾腎虧、氣血不足為本，痰濁、瘀血、風寒濕邪為標，采用益氣養血、溫陽通絡等法進行治療可取得不錯的療效。益氣養血方為吳氏經驗方

13、，臨床運用30余年，療效較好。前期實驗表明，本方可以抑制atdc5軟骨細胞凋亡，降低細胞上清液炎性因子白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-產生及bax蛋白表達，上調atdc5軟骨細胞bcl-2蛋白表達，從而發揮治療oa的作用7。本研究是在前期研究基礎上，從調控wnt通路相關分子角度進一步探討益氣養血方對oa軟骨退變的作用及機制。1 實驗材料1.1 實驗動物 spf級sd雌性大鼠70只，2月齡，體質量160180 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：scxk（川）2015-030）。質量合格證號：no.0015199。由四川省實驗動物檢測中心檢測。飼養于云南省中醫醫院中心實驗室spf級動

14、物房許可證號：syxk（滇）-k2013-0002。溫度（21±2），濕度（55±5）%，12 h光暗循環。飼料和水均由動物自由攝取，所有籠具、飼料和飲水均經過121 蒸汽滅菌處理。實驗期間均予spf級普通飼料。1.2 實驗藥物 益氣養血方由黃芪、黨參等14味中藥組成，由云南中醫學院第一附屬醫院中藥房提供。原藥材混合后加水煎煮3次，第1次10倍水，煎煮1 h，濾過。第2次7倍水，煎煮1 h，濾過。第3次3倍水，煎煮30 min，濾過。合并3次濾液，3000 r·min-1離心機離心10 min，60 恒溫旋轉蒸發儀蒸餾濃縮制備浸膏，稱重，折合原藥材為每1克浸膏含生

15、藥2.53 g。雙氯芬酸鈉腸溶片（北京諾華制藥有限公司，生產批號x1008）。1.3 主要試劑和設備 wnt4、wif1 elisa試劑盒（美國r&d，生產批號e20160901a、e20160901c）；乙二胺四乙酸二鈉、復方金霉素軟膏（昆明振華制藥廠，生產批號20150701）；采血管、bio-rad 680酶標儀（美國伯樂公司）；megafugel 1.0r離心機、rm2235石蠟切片機、eg1150h + eg1130c組織包埋機、hi1210烘片機、dm2500正置顯微鏡、asp300s全自動組織脫水機（德國萊卡儀器有限公司）。2 方 法2.1 動物分組與造模 將70只大鼠按

16、照隨機數字表法分為益氣養血方低、中、高劑量組，陽性對照組，模型對照組，空白對照組及假手術組，每組10只。除空白對照組及假手術組外，其余各組大鼠用改良hulth法8造模，采用質量分數為10%的水合氯醛腹腔麻醉后，碘伏消毒，均取右側膝關節內側長約1 cm切口，從髕韌帶內側進入關節腔，切斷前交叉韌帶、內側副韌帶，切除內側半月板，抽屜試驗陽性，關節復位后逐層縫合切口。假手術組入路同前，切開關節囊，暴露關節腔后，不切斷前交叉韌帶、內側副韌帶，不做半月板切除，隨即縫合切口。復方金霉素軟膏涂抹傷口預防感染，連續給藥7 d。空白對照組不做任何處理。2.2 動物給藥 造模7周后，依據臨床常用劑量，按人與大鼠體表

17、面積比計算大鼠臨床等效劑量，人按70 kg計算出大鼠用藥量益氣養血方高、中、低劑量組分別為7.56 g·kg-1·d-1、3.78 g·kg-1·d-1、1.89 g·kg-1·d-1（分別為臨床等效劑量、1/2等效劑量、1/4等效劑量），實驗時以雙蒸水按劑量配置成所需濃度；陽性對照組給予雙氯芬酸鈉腸溶片混懸液4 mg·kg-1·d-1灌胃；假手術組、模型對照組給予生理鹽水2.5 ml·d-1灌胃；空白對照組正常飼養，不予任何藥物。各組連續給藥8周。2.3 標本制備 采用質量分數為10%的水合氯醛腹腔麻醉

18、，腹主動脈取血，血液靜置4 h后，4 3000 r·min-1離心機離心15 min，取上層血清，凍存-20 ，以備elisa檢測。取右側膝關節，每組隨機選取5個關節，剩余關節凍存于-80 冰箱，以備pcr檢測。剝離關節周圍組織，置于質量分數為10%的中性甲醛溶液中固定，采用質量分數為10%的edta脫鈣，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，厚度6 m。2.4 檢測指標及方法2.4.1 形態學觀察 大體觀察，he染色，光鏡下觀察，每個標本取5張切片，每張切片顯微鏡下放大200×，選取5個視野。參照mankin評分法9設置以下評分標準進行關節軟骨病理評分。軟骨結構：光滑

19、如常，0分；表層破壞，1分；血管翳及表層破壞，2分；淺層裂隙形成達移行層，3分；裂隙局限性深達骨質輻射層，4分；深達骨質鈣化層軟骨，5分；全層軟骨缺損，6分。軟骨細胞：數量如常排列整齊，0分；數量彌漫性增多，1分；出現大量集簇細胞團，2分；數量明顯減少，3分。基質染色：均勻，層次分明清楚，0分；不均勻，層次分明清楚，1分；不均勻，部分層次不清，2分；不均勻，重度染色，3分；失染，4分。潮線完整性：完整，1分；有血管翳生成，2分。 2.4.2 elisa法檢測大鼠血清wnt4、wif1表達水平 按照試劑盒說明書。操作如下：從-20 冰箱中取出冰凍血清，室溫解凍備用。將試劑盒從4 冰箱取出，室溫平

20、衡20 min。選用96 t板，設標準孔和待測樣品孔。標準品孔各加不同濃度的標準品50 l，樣品孔加入待測樣品10 l，再加樣本稀釋液40 l，空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔均加入辣根過氧化物酶（hrp）標記的檢測抗體100 l，用封板膜密封。37 恒溫箱溫育60 min后，揭掉封板膜，棄去液體，在吸水紙上拍干，每孔加足量的洗滌液，靜置1 min，將洗滌液甩去，吸水紙上拍干，如此反復5次（注意洗板時要甩盡液體，拍干，以免影響結果）。每孔加入底物溶液100 l，37 避光溫育15 min。每孔依次加終止液50 l，終止反應（此時顏色改變，一般顏色越深說明陽性程度越高）。在加入終止

21、液的15 min內用酶聯儀在450 nm波長處測定各孔的光密度（od值）。同時繪制標準曲線。2.5 統計學方法 采用spss 18.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，多組間數據比較采用單因素方差分析，符合正態分布和方差齊性檢驗采用lsd法檢驗，方差不齊則采用校正t檢驗。以p < 0.05為差異有統計學意義。3 結 果3.1 大體形態觀察 空白對照組可見關節面平滑完整，關節軟骨光潔，半透明，質地堅韌富有彈性，無裂隙，膝關節未見腫脹及萎縮，關節囊未見增厚，滑膜無充血粘連，關節液量少清澈。模型對照組可見滑膜增厚充血，軟骨表層糜爛纖維化，觸之較軟，脛骨平臺可見增生，關節囊增

22、厚，關節積液明顯增多，渾濁黏稠；陽性對照組滑膜充血較輕，軟骨顏色變淺，軟骨表面粗糙，局部潰瘍、纖維化，關節液量較多，渾濁。益氣養血方各劑量組滑膜較模型對照組充血較輕，軟骨表層比較光滑，未見明顯裂隙與增生，關節積液量少。3.2 he染色 空白對照組、假手術組可見軟骨表層光滑，平整，軟骨細胞排列整齊，染色分布均勻，潮線完整，無明顯細胞集簇現象；模型對照組軟骨表層潰瘍變薄，局部裂隙缺損，軟骨細胞排列不整齊，局部細胞集簇明顯，局部細胞數量減少，染色不均勻；陽性對照組軟骨層變薄，表層欠光滑、裂隙，軟骨細胞排列尚整齊，少量集簇，染色不均勻、輕度缺失，潮線完整；益氣養血方低劑量組軟骨表層不光滑，部分潰瘍，軟

23、骨細胞排列紊亂，細胞集簇，基質染色不均勻，潮線完整；益氣養血方中劑量組軟骨表層欠光滑，局部有表淺的裂隙，軟骨細胞排列較規則，局部細胞集簇，基質染色尚均勻，潮線較完整；益氣養血方高劑量組軟骨表層較光滑，軟骨細胞集簇，無明顯裂隙，潮線完整。見圖1。3.3 各組大鼠關節軟骨病理評分比較 模型對照組的病理評分明顯高于空白對照組、假手術組（p < 0.05），益氣養血方各劑量組及陽性對照組低于模型對照組（p < 0.01），益氣養血方中、高劑量組病理評分低于陽性對照組（p < 0.05或p < 0.01）。見表1。3.4 各組大鼠血清wnt4、wif1水平比較 與空白對照組、假手

24、術組比較，模型對照組大鼠血清中wnt4水平升高，wif1水平降低（p < 0.05或p < 0.01）；與模型對照組比較，益氣養血方中、高劑量組大鼠血清中wnt4水平降低，wif1水平升高（p < 0.05），其中高劑量組更為明顯（p < 0.01）；與陽性對照組比較，益氣養血方中、高劑量對wif1的上調作用更為明顯（p < 0.05）。見表2。4 討 論目前，koa尚缺乏有效的治療手段，臨床常用非甾體抗炎藥、糖皮質激素、改善病情抗風濕藥等治療。陽性對照藥物雙氯芬酸鈉腸溶片為非甾體抗炎藥，通過抑制環氧合酶（cox）的活性，使前列腺素的合成減少，從而減輕或控制炎癥反

25、應。有研究表明，雙氯芬酸可以抑制wnt/-catenin信號傳導，同時減少-catenin/tcf依賴性基因的表達且能夠促進人oa軟骨細胞分泌型膠原10，從而減少軟骨基質的降解丟失，保護關節軟骨；但對-catenin蛋白水平的影響不明顯11。氨基葡萄糖能夠促進蛋白多糖的合成，提高軟骨細胞的修復能力，抑制溶酶體酶、金屬蛋白酶、膠原酶和磷脂酶a2等水解酶的釋放，減少關節軟骨基質的降解破壞，從而保護和修復關節軟骨；但對wnt/-catenin通路是否有作用未見報道，本研究旨在研究益氣養血方通過wnt/-catenin信號通路干預oa的機理，故以cox-2抑制劑雙氯芬酸鈉腸溶片為陽性對照藥物。經典的w

26、nt/-catenin信號通路可以調節機體很多生物學過程如細胞增殖、分化、凋亡、衰老等12，在軟骨、骨代謝及骨骼系統發生發展的全過程及oa的病程中起著重要作用13。wnt4是wnt信號通路中的重要因子之一，其表達增高可激活下游的-catenin過量表達，促使關節軟骨細胞過度成熟、分化及凋亡，使存在于軟骨基質中的各種蛋白酶的表達及活性增加，從而加重細胞外基質（ecm）的降解、關節軟骨的退變和最終骨贅的形成14。wif1即wnt信號通路抑制因子1，為wnt拮抗物家族成員之一，可以直接與wnt相結合，阻斷wnt與受體蛋白復合物的結合途徑，促使細胞質中的-catenin不斷磷酸化而難以積累，從而阻斷w

27、nt/-catenin信號通路的活化15-16，減少ecm的降解和關節軟骨的破壞。本研究表明，模型對照組大鼠關節軟骨表層潰瘍變薄，he染色關節軟骨表面缺損裂隙，細胞集簇，基質染色不均勻，提示關節軟骨基質降解，關節軟骨退變；益氣養血方各劑量組和陽性對照組在關節軟骨表層肉眼觀察、he染色關節軟骨退變有明顯改善，病理評分降低（p < 0.05），表明益氣養血方可以改善koa大鼠病理評分，保護關節軟骨。wnt4和wif1作為wnt/-catenin信號通路上游因子，通過對wnt信號及-catenin水平的調控，調節機體細胞周期、ecm合成與降解及軟骨細胞的成熟、分化與凋亡17。wnt4持續增高引

28、起-catenin持續表達，促使生長板軟骨細胞肥大及其終端分化，刺激基質金屬蛋白酶分泌，致使關節軟骨基質降解，加速關節軟骨破壞13。wnt的異常活化使wif1消耗增多、水平降低，-catenin持續在細胞質內積累，并向細胞核轉移，繼而與轉錄因子tcf/lef結合，刺激wnt信號下游靶基因轉錄18。本研究結果提示，模型對照組wnt4水平明顯高于空白對照組和假手術組（p < 0.05），wif1水平低于后兩者（p < 0.01）。與模型對照組比較，益氣養血方各劑量組和陽性對照組wnt4水平均有所降低，wif1的表達升高，但陽性對照組差異無統計學意義（p > 0.05）。表明益氣養

29、血方可以降低wnt4的產生水平，增加wif1的表達。 益氣養血方又名補中桂枝湯，以李東垣補中益氣湯與傷寒論桂枝湯合方化裁而成，具有益氣養血、補腎健脾、通經活絡之功，臨床運用30余年，取得較好的臨床療效，且無明顯不良反應。方中以補中益氣湯調補脾胃、益氣養血，桂枝湯調和營衛、通經活絡，配以細辛散寒止痛，川芎行氣活血，骨碎補、淫羊藿補腎壯骨，標本兼治。研究表明，本方可以改善oa患者臨床癥狀積分，降低紅細胞沉降率、c-反應蛋白19；對體外培養的oa患者退變軟骨細胞增殖有促進作用，促使aggrecan mrna表達上調，下調col-10 mrna的表達20。本研究從wnt信號通路上游調控分子角度探討益氣

30、養血方對koa大鼠血清wnt4、wif1水平及膝關節軟骨組織的影響，揭示其治療oa的部分機制。研究結果表明，益氣養血方可以有效延緩koa大鼠關節軟骨的退變，改善koa大鼠病理評分，推測其可能的作用機制是通過抑制wnt4的表達，升高wif1的水平，從而減少-catenin的產生、積累，延緩koa軟骨退變。但信號通路是一個復雜的協同系統，本方對滑膜及軟骨組織中相關因子下游相關靶基因如-catenin及其他oa的相關信號通路的作用及其機制，還需進一步研究和探討。5 參考文獻1 nielsen rh，byrjalsen i，karsdal ma，et al.oral salmon calcitonin

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