1、    rna提取、定量及rtpcr綜合性實驗在分子生物學檢驗技術教學中的實施    李江濱+巫媛+李育超+侯敢摘 要 分子生物學檢驗技術是醫學檢驗專業重要的專業課程，實驗教學尤其是綜合性實驗的教學對學生綜合技能的培養至關重要。本文從實驗設計思路、 組織實施、 實施效果、 教學體會等方面闡述rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗在分子生物學檢驗技術教學中的實施，并分析教學中存在的問題，提出相應的解決對策，為有關院校開設相關綜合性實驗教學提供參考。關鍵詞 rna 綜合性實驗 分子生物學檢驗技術 教學：g424 ：a doi：10.16400/ki.kjd

2、kx.2016.12.042abstract molecular biology diagnostic technique is an important professional course in laboratory medicine. experimental teaching， especially the teaching of comprehensive experiment is very important to the cultivation of students' comprehensive skills. this paper expound the teac

3、hing implementation of comprehensive experiment “extraction and quantification of rna and rt-pcr” in molecular biology diagnostic technique from the experimental design ideas， organization， implementation， implementation effect， teaching experience and so on. analyze the problems existing in the tea

4、ching， and put forward the corresponding countermeasures. provide a reference of teaching on experiment of “extraction and quantification of rna and rt-pcr” for some colleges.keywords rna； comprehensive experiment； molecular biology diagnostic technique； teaching1 實驗設計思路rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗主要由rna提取、

5、rna定量和rt-pcr這三個部分組成。在本校的實驗設計中，目標基因采用常用 -actin基因片段。實驗首先用trizol試劑提取小鼠肝臟總rna，然后用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取rna的純度和含量，最后利用引物oligo（dt）在逆轉錄酶作用下制備cdna模板，通過小鼠 -actin基因的特異引物擴增出 -actin基因片段，并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測擴增產物。實驗內容涉及rna的分離與純化技術、紫外比色技術、凝膠電泳技術、rt-pcr技術等研究技術與方法，具有較好的實用性和先進性。2 實驗組織實施rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗所涵蓋的知識面非常廣，整個實驗歷時長，對

6、學生的細心程度和實驗技能要求較高，在實驗過程中，有些試劑（比如trizol試劑和氯仿）有強烈的刺激性氣味且伴有毒性，而且任何一個環節的微小錯誤，都有可能導致實驗最終失敗，故實驗需要在特殊環境下（如通風櫥）進行。為了使學生在實驗中能夠學到更多的知識，并且順利地完成實驗，首先，學生應該在實驗課前通過實驗指導書和互聯網了解實驗的相關內容進行預習，熟悉實驗的原理、儀器的使用方法、試劑的作用、操作步驟和注意事項，并與其他學生討論預習過程中遇到的問題，若仍不能解決，則在老師講解實驗時邊聽邊思考，務必在做實驗之前弄懂實驗的關鍵點和每個步驟的目的，盡量避免盲目操作和錯誤操作；其次，實驗施教時，教師通過ppt展

7、示和現場演示進行講解，同時提出問題讓學生回答，加深學生對實驗要點的理解，并解答學生在預習過程中遇到的疑惑；再次，學生了解清楚每個步驟的操作、目的和注意事項后，開始進行實驗，實驗過程中，學生嚴格按照實驗指導的說明來進行操作，在通風廚中進行加樣，且要注意戴好口罩和手套，防止酶等因素影響實驗，教師應督促和提醒學生是否有不當的操作，輔助學生完成實驗；最后，教師對實驗結果進行引導性的講解，布置學生寫實驗報告，并要求學生在實驗報告中結合實驗原理對結果進行分析討論，寫明實驗中的注意事項和實驗要點，提出一些具有探究性的問題，以此啟發學生的邏輯思維和創新思維，加深學生對實驗的了解，并在一定程度上激發學生對分子生

8、物學檢驗技術實驗的興趣。3 實驗實施效果3.1 鞏固理論知識，提高運用知識能力由于分子生物學檢驗技術這門學科的理論知識較為抽象、復雜難懂，學生在預習實驗的過程中，需要查閱書本、上網觀看實驗視頻或者在網上查找資料以便更好地理解實驗原理、操作步驟和注意事項，等等。同時，學生也對這個實驗所涉及的知識點有了更好的掌握。學生在分析實驗結果的過程中，復雜、抽象的理論知識轉化成實物（比如凝膠電泳結果、測量吸光度的結果等等），可以幫助學生對課本中的知識點有更清晰的認識，這正是每個實驗所要達到的目的。3.2 提高獨立解決問題的能力和自主學習能力在學生預習實驗的過程中，通過網絡資源觀看與此實驗有關的flash動畫

9、、視頻，瀏覽一些圖片和文字解說，或者是學生之間的交流，都有益于解答實驗前的各種疑惑，這樣既鍛煉了學生在網絡上查找資料的能力，同時也提高了學生獨立解決問題的能力，而不會在實驗課時依賴老師的講解或者盲目地照著實驗指導書做實驗。 3.3 提高實驗操作技能分子生物學檢驗技術實驗的特色之一就是微量，在此綜合性實驗中，加入氯仿離心后，需要在一個較為復雜的體系中吸取水相中的rna，此過程伴有少許刺激性氣味，再加上吸取的量非常少，很容易吸到有機相中的蛋白質或漂浮在液面上層的苯酚，因此，在這個步驟中，學生的實驗操作技能可以得到很好的鍛煉；另外，在逆轉錄制備cdna和pcr擴增 -actin基因片段這兩個步驟中，

10、整個體系都是只有20 l，其中的模板、引物、酶、dntp和緩沖液都不超過5 l，學生們加樣時需要格外小心，比如加樣之前觀察槍頭，預測所吸的溶液量是否達標，加樣時全神貫注，片刻的分心都有可能導致實驗失敗，學生對于微量加樣的操作能力可以在此過程中得到極大的提高。3.4 增強主觀能動性，提高興趣實驗過程中，學生全程獨立完成，從微量加樣到啟動離心機，從瓊脂糖凝膠制備到啟動電泳儀，教師只起到督促和提醒的作用，這樣學生可以全身投入，積極性很快就被調動起來，并對這門學科產生濃厚的興趣，在這種情況下，一個良好的綜合性實驗可能成為學生學習分子生物學檢驗技術的動力源泉和啟蒙點。3.5 增強團隊意識隨著現代科技的飛

11、速發展，科學研究越來越重視團隊合作，單靠一個人的力量很難事事通曉、面面俱到，因此，教師應該有意識地培養學生與他人合作、交流、溝通的能力。在rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗中，幾乎每一步都牽涉到團隊合作，比如為了高效率地進行實驗，需要等齊所有同學才開啟離心機、pcr擴增儀，還有，瓊脂糖凝膠電泳過程中學生們的相互協作是實驗成功的關鍵，因此，這個實驗有效地提高了學生的團隊意識。4 教學體會rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗所涉及的知識面非常廣，耗時較長，學生很難掌握每一個實驗操作步驟和注意事項，也很難從始至終保持注意力的集中，筆者提出對此實驗存在的問題及相應對策總結如下：（1）學生上實

12、驗課前不預習的現象普遍存在，在實驗過程中只是“照單抓藥”機械性地操作，以致他們對實驗原理、操作、結果等不理解。完全依賴教師在實驗課上的講解來學習實驗是遠遠不夠的，而且實驗課的學時有限，教師的講解只是起引導性的作用，需要學生通過查找資料等課前預習的方式才能學習得更加細致和深入。所以，應鼓勵學生在課前通過課本和網絡資源預習實驗，必要時教師可以在課前對學生進行有關實驗內容的提問，以提高學生課前預習的積極性。（2）實驗過程中有些學生因操作失誤導致實驗的誤差過大甚至實驗失敗，比如在rna提取過程中的微量加樣和微量吸取，都是容易引起較大誤差的操作，部分學生因操作失誤使提取的rna純度過低；有些學生在制備c

13、dna和pcr擴增 -actin基因片段體系中漏加、多加試劑，導致 -actin基因片段擴增失??；還有些學生在瓊脂糖凝膠電泳加樣時戳破凝膠，或沒有將樣品準確加入梳孔中。這些失誤多為學生操作不熟練或者沒有經過課前的預習所致，教師在實驗過程中除了做示范，引導學生之外，還應多鼓勵學生，告訴他們不必緊張。有條件的實驗室還可以在周末開放實驗室，讓學生吸取失敗的教訓之后第二次進行實驗，彌補第一次實驗的失誤，同時也給學生一個練習操作的機會。（3）實驗課結束后，有部分學生對實驗報告的態度不認真，只是照抄實驗指導書的目的、原理、操作步驟，再加上實驗結果，這樣會大幅度降低了實驗的預期效果，達不到完整的教學目的。對

14、于這種情況，教師可以引導學生重視實驗報告的討論部分，比如，各個操作步驟的目的，實驗的關鍵點和注意事項，對實驗結果的分析，以及學生在實驗過程中的體會等等。務必使學生將實驗課中所遇到的問題與理論知識聯系起來，解答問題并寫在實驗報告中，達到實驗課和理論課相互輔助的目的。（4）rna提取、定量及rt-pcr綜合性實驗大約需要8個學時，在排課時有兩種可行方案。第一，可以將此綜合性實驗分為兩次完成，第一次在完成rna定量后結束，將另一部分提取好的rna置于-20 保存，第二次實驗時取出rna繼續完成rt-pcr部分。分兩次課做完這個綜合性實驗。第二，課時安排允許的情況下，也可以在一天內，如上午加下午或下午

15、加晚上，一次性完成此綜合性實驗，保證實驗的連貫性，使同學們做實驗時有更清晰的思路，更容易理解實驗的前因后果。*通訊作者：侯敢基金項目：廣東省高等教育教學改革項目“基于培養學生創新能力的分子診斷學實驗教學綜合改革與實踐”，廣東省高等教育教學改革項目“醫學檢驗技術專業實施班導師制的探索與實踐”，廣東省本科高校教學質量與教學改革工程項目、廣東醫科大學教學質量與教學改革工程建設項目“臨床生物化學檢驗教學團隊”。參考文獻1 李江濱，林錦瓊，李育超，等.“重組質粒的轉化、提取及酶切分析”綜合性實驗在醫學檢驗專業分子診斷學教學中的實施j.教育教學論壇，2013.35：272-273.2 褚玉新，王曉春.醫學檢驗本科分子診斷學實驗教學的探討j