1、 本科生畢業設計（論文）開題報告 題 目： 微藻中總油脂的提取與富集 學 院： 生命科學與食品工程學院 系 生物技術系 專 業： 生物工程 班 級： 生工092 學 號： 5602209078 姓 名： 沈峰 指導教師： 萬益琴 填表日期： 2013 年 04 月 02 日 一、選題的依據及意義： 近年來注意格式，修改成首行空兩格，行距你看看要求吧，另外文中的所有數字都要改成times new roman，國際市場石油價格不斷高企，我國從1993年起已經成為一個石油進口國。進口原油不但用去大量外匯，而且主要從局勢不穩定的中東地區進口，一旦有突發事件發生，就會造成石油供應減少或中斷，將嚴重威脅國

2、家安全和國民經濟的發展。 并且油脂與人類的關系越來越密切,無論是作為生物柴油的原料還是加工成為保健食品,油脂都具有至關重要的作用。目前,油脂的主要來源仍然是植物以及動物脂肪,但是這種傳統的油脂來源已經不能完全滿足人們食用、工業等生活中的各種需求。 在世界能源形勢日趨緊張的大背景下，尋找一種綠色的可持續發展的新能源，成為各國普遍關注的科學問題。其中利用海洋微型藻類制取柴油、乙醇等，已在日美等國科學界開始探索。我國也應立即啟動微藻制油技術的研究，以應對“后石油時代”的能源危機。 據了解，我國的有機碳組成中，海洋藻類占了，藻類是一種數量巨大的可再生資源，也是生產生物質能源的潛在資

3、源，其中微型藻類的含油量非常高，可以用于制取生物柴油。 中國海洋大學管斌認為，利用藻類生物質生產液體燃料，對緩解人類面臨的糧食、能源、環境三大危機，有著巨大的潛力，對于減少對石油的依賴、保證國家能源安全具有深遠意義。     微藻是能夠進行光合作用的微生物,它可以利用陽光、水和co2 合成自身所需要的物質。許多微藻含油量極高,據保守估計,每年每公頃微藻可生產30 00050 000 l 油脂,而富油植物如棕櫚和麻風樹等每年每公頃的油脂產量僅13002 400 l;微藻還具有環境適應能力強、生長周期短、生物產量高 和不占用農業用地等特點,因此,微藻油脂越來越受到國內

4、外學者的廣泛關注。2、 國內外研究現狀及發展趨勢（含文獻綜述）： 目前微藻生物柴油生產正由實驗室轉向小規模工廠化生產。國際微藻生物質高峰論壇于2007年11月在舊金山召開。目前數家公司正在進行微藻生物柴油商業化試生產。1、 利用細胞工程技術制備微藻及生物柴油 清華大學繆曉玲等通過異養轉化細胞工程技術獲得了高脂含量的異養小球藻細胞，其脂含量高達細胞干重的55（質量分散），是自養藻細胞的4倍。此外，清華大學還應用細胞培養技術（異養發酵技術）控制有機與無機c、n的供給，獲得葉綠素消失、細胞變黃的異養小球藻。異養小球藻細胞中油脂類化合物大量增加，蛋白質含量下降。與未經轉化的自養藻相比，異養藻細胞和粗脂

5、肪含量提高了4倍以上。中科院植物研究所和中科院水生生物研究所的科研人員借鑒美國的經驗教訓，在較短的時間內，通過基因工程開發出了高產的油藻品種。青島海洋大學經過十幾年的淡水及海水藻類物質的研究，也已積累了豐富的海洋藻類開發和產業化的經驗。2 、利用分子生物學和基因工程技術制備微藻 19781996年，美國能源部從微藻中開發可再生燃油的科技項目中投資2500多萬美元。美國能源部的研究項目已經確切證實了硅藻具有極高的生長能力，確定了微藻在單位面積及單位時間上比陸生作物能提供更多的能量。更重要的是，微藻生產不必占用糧食生產土地。美國的研究首先從收集微藻樣本開始，通過篩選、表征，再進行統計分析，得出制約

6、微藻產量和產油量的關鍵因素，并探明了微藻細胞的生理和生化特征，最終采用分子生物學和基因工程技術，改變微藻細胞的生理結構，制備出高產量、高含油量的工程微藻，并實現了工業放大。 除了美國能源部的相關研究之外，美國圣地亞哥國家實驗室在美國livefuels公司資助下，已經進行了將近7年的研究，其研究內容也是關于利用分子生物學反應工程技術，來增加微藻細胞的含油量和產量，其目標是到2010年可得到經濟可行的生物柴油。目前，他們已經積累了豐富經驗，制得的海藻油與大豆油類似，完全可以用來生產生物燃料。經研究發現，海藻可以在不適合種植莊稼的土地上種植，甚至可以生長在咸水里。他們通過對一種特種海藻的研究表明，僅

7、需美國土地的0.3就可生產出滿足全美國需要的運輸用燃料，且與商用海藻如螺旋藻相比，該工程微藻油脂含量要豐富得多。三、本課題研究內容本論文的主要內容是在篩選得到小球藻的純培養物的基礎上，對小球藻進行一定量的擴大化培養，再經過離心干燥等步驟獲取小球藻干粉。對采用有機溶劑法提取小球藻干粉的中性總脂，并對利用各種不同溶劑萃取和，利用超聲波因素進行單因子試驗，等方法對油脂進行提取富集，驗證從而得到得油率最高最好的小球藻中性總脂的提取和富集油脂的方法。具體內容如下：1、純種小球藻培養物的獲得和對篩選出的小球藻進行大量的繁殖培養；具體操作為：1) 小球藻菌種的分離和純化。固體培養基的配制：小球藻常用的培養基

8、為bg11培養基，1 l培養基中需加入的成分種類和數量及保存液如下： bg11 ( blue-green medium) 成分 數量 保存液 (1) nano3 100 ml/l 15.0 g/l dh2o (2) k2hpo4 10 ml/l 2 g/500 ml dh2o (3) mgso4·7h2o 10 ml/l 3.75 g/500 mldh2o (4 ) cacl2·2h2o 10 ml/l 1.8 g/500 ml dh2o (5 ) 檸檬酸 10 ml/l 0.3 g/500 ml dh2o (6 ) 檸檬酸鐵銨 10 ml/l 0.3g/500ml dh2

9、o (7 ) edtana2 10 ml/l 0.05g/500ml dh2o (8) na2co3 10 ml/l 1.0g/500ml dh2o (9) a5 （trace mental solution,微量元素） 1ml/l h3bo3 2.86g/l dh2o mncl2·4h2o 1.86g/l dh2o znso4·7h2o 0.22g/l dh2o na2moo4.2h2o 0.39g/l dh2o cuso4. 5 h2o 0.08g/l dh2o co(no3)2.6 h2o 0.05g/l dh2o 利用1m naoh or hcl調節ph至7.1，瓊

10、脂粉的加入量為培養基的1.5 %。具體步驟： 1、培養基保存液的配制，按照前面列出的bg11的培養基保存液的濃度配制各種保存液。2、 每個250 ml的三角燒瓶，按照上面培養基的配方，配制100 ml bg11的固體培養基（調ph至7.1）。3、 用錫紙包扎瓶口，放入高壓滅菌鍋中在121 處理20 min。4、 取出培養基，倒入兩個9 cm平皿中（每個皿倒入20-30 ml的培養基，步驟4和5均需在在超凈工作臺上操作），待其冷卻并適當的干燥。5、 接種環蘸取藻液接種物（接種物的制備：取培養l0天左右的對數生長末期的新鮮藻液，經5000rpm離心15min，后棄去上清，用培養液洗滌一次，再以培養

11、液懸浮用于接種(實驗操作在無菌條件下進行)，密密劃線。6、 倒置于28 光照培養箱中進行培養。2) 小球藻擴大化培養1、在1000 ml 的燒杯，按前一個實驗中的bg11的配方，配制500 mlbg11液體培養基，調ph至7.1。每個500 ml瓶中裝入200 ml bg11的液體培養基，150 ml的三角瓶裝入50 ml。2、 用錫紙包扎瓶口，放入高壓滅菌鍋中在121 處理20 min。3、 用滅菌的牙簽挑取生長較好的單株的小球藻放入裝有l ml ddh20并滅菌過的eppendorf管中，混合物用槍頭吹打均勻。4、 將吹打均勻的球藻移入裝有50ml bg11液體培養基中，25 光照振蕩培養

12、（230 r/min）過夜。 5、 各取25 ml培養后的藻液加入到裝有200 ml bg11液體培養基進行培養。6、 正常的培養條件：25 ，230 rmin，24 h全光照（強度為3500 lux）振蕩培養。2、培養得到的小球藻細胞的收獲和干燥；3、小球藻干粉中的總油脂的提取（有機溶劑法）；4、利用超聲波等方法對其進行作用，。4、 本課題研究方案本實驗設計基于當前能源短缺的國際形勢，擬通過大量培養已經純化過的目前正在應用于生產生物柴油的普通小球藻藻株，并對小球藻油脂進行提取與富集。但這些藻株的產油率情況還不是很清楚，所以將其進行收集以得到適應的小球藻干粉，采用幾種不同的有機溶劑提取等方法，

13、并利用超聲波進行處理，提取不同藻株中的總油脂，計算不同溶劑萃取條件下的產油率。最后對這些數據進行綜合分析，從而可以驗證幾種溶劑中效率最高的有機溶劑。5、 研究目標、主要特色及工作進度： 研究目標：通過不同的溶劑萃取，加上超聲波的作用驗證哪個提油效果好。 主要特色：1、 對環境無污染 微藻能夠有效地利用太陽能，通過光合作用固定二氧化碳，將無機物轉化為氫、高不飽和烷烴、油脂等能源物質；而且微藻生物能源可以再生，燃燒后不排放有毒有害物質，對大氣二氧化碳沒有凈增加。 2、 微藻的來源豐富 微藻的種質資源豐富，不會因收獲而破壞生態系統，可大量培養而不占用耕地；另外，它的光合作用效率高，生長周期短，倍增時

14、間約3-5天，有的藻種甚至一天可以收獲兩季，單位面積年產量是糧食的幾十倍乃至上百倍。而且微藻脂類含量在，這是陸地植物遠遠達不到的，可用于生產生物柴油或乙醇，還可望成為生產氫氣的一條新途徑。 3、 微藻的產油率高 微藻的產油效率相當高，在一年的生長期內，一公頃玉米能產升生物質燃油，一公頃大豆能產升，一公頃油菜籽能產升，一公頃棕櫚樹能產升，而一公頃的微藻能產生物質燃油升。 據專家介紹，微藻的個體小，木素含量很低，易被粉碎和干燥，用微藻來生產液體燃料所需的處理和加工條件相對較低，生產成本低。而且微藻熱解所得生物質燃油熱值高，平均高達33mj/kg，是木材或農作物秸稈的1.6倍。 工作進度第一、二周主

15、要工作：查閱有關的相關文獻，了解本畢業設計項目的目的意義及可能用到的實驗技術手段，在老師的指導下初步確定試驗方案。：第三、四周）學生主要工作：開始進入實驗室，了解實驗室的一些規章制度，初步掌握各項實驗技術手段，熟悉各種可能的實驗操作過程，準備實驗材料和試劑。第五、六周）學生主要工作：對小球藻進行大量的培養。 第七、八周）學生主要工作：經過離心和干燥收集小球藻干粉。第九、十周、）學生主要工作：利用幾種不同的有機溶劑和超聲波對小球藻的油脂進行提取。、第十一周至畢業論文工作結束、學生主要工作：收集數據，結合文獻，撰寫論文。、 6、 參考文獻： 【1】張根旺生物柴油的生產及發展前景糧油食品科技。【2】

16、任慶功，閻杰，丘泰球，等超聲作用下堿催化大豆油酯交換反應制備生物柴油化學與. 生物工程。【3】董月生物柴油現狀與發展.化學工程與裝備，【4】韓笑天，鄭立。孫珊，等海洋微藻生產生物柴油的應用前景海洋科學，【5】繆曉玲，吳慶余微藻油脂制備生物柴油的研究太陽能學報。【6】劉斌，陳大明，游文娟，等微藻生物柴油研發態不同氮源形態和植物激素對小球藻ustb01生長及葉黃素含量的效應 王素琴，閆海，張賓億，呂樂，林海 科技導報 2005,23(12) 【7】小球藻(chlorella vulgaris)產油脂最佳培養條件的篩選 梁詠恩，彭少泓，謝旋，王瑩 河南師范大學學報（自然科學版）2010,38(6)【8】小球藻培養條件的優化 季祥，張智慧，張雪艷，蔡祿 安徽農業科學 2009,37(34)【9】從小球藻中提取和富集多不飽和脂肪酸的研究 陳煒，王保剛，李曉東，白永安，張敏 大連海洋大學學報 2 0 1 0年6月第25卷第3期 【10】小球藻提取物的生物活性研究 劉海琴，韓士群 海洋科學 2005,2