1、金針菇液體菌種培養基和培養條件優化摘要：液體菌種的應用是金針菇工廠化生產的關鍵技 術和發展趨勢。本研究以金針菇21作為供試菌株，通過搖 瓶培養，比較了不同碳源和氮源對液體菌種質量的影響，結 果發現，玉米粉為最佳碳源，獲皮為最佳氮源；通過正交試 驗對培養條件進行優化，結果顯示，搖床轉速150 r/min、 裝液量60 ml （三角瓶，250 ml容量）、接種量12% （v/v）、 培養溫度221時所得液體菌種質量最優，菌絲干質量達 1. 821 5 g/100 mlo栽培試驗結果顯示，菌齡5 d的液體菌 種最適合栽培應用，栽培周期比使用固體菌種短，產量也高 約 5. 8%o關鍵詞：金針菇；液體菌

2、種；培養基；培養條件；優化 中圖分類號：s646. 1+5文獻金針菇（flammulina velutipes）是一種優質食用菌， 富含蛋白質、氨基酸、維生素、礦質元素等多種營養物質1, 以及樸菇素（flammutn）、蒜菇素、金針菇原素（flamn）等 功能活性成分，具有抗腫瘤、調節免疫力、促進智力發育、 護肝等作用2,早已成為人們熟知的保健食品。隨著技術 的革新和國內外市場需求的增長，金針菇生產方式已由傳統 作坊式、季節性生產，向設施化、工廠化生產方式轉變3。 作為金針菇工廠化栽培的關鍵技術之一，液體菌種具有生產 周期短、接種便利、菌絲分散性好、萌發點多、生長快、成 品率高等優點，液體菌種

3、的應用已成為食用菌菌種及規模 化、工廠化生產的發展趨勢4。本研究采用液體搖瓶培養, 對金針菇液體菌種的培養基和培養條件進行了優化，以期為 金針菇栽培技術的提升提供科學依據。1材料與方法1. 1試驗菌株金針菇21,購自華中農業大學菌種實驗中心。1.2培養基 碳源篩選培養基在基礎培養基（蛋白膿1%, kh2p04 0. 1%, mgs04 0. 05%,維生素 bl 1 mg/l） 中，分別加入 2% 的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉4種碳源，1211261 滅菌20 min,冷卻備用。 氮源篩選培養基在基礎培養基（葡萄糖2%, kh2p04 0. 1%, mgs04 0. 05%,維生素 bl

4、 1 mg/l） 中，分別加入 2% 的蛋白豚、酵母膏、魏皮3種氮源，滅菌，備用。 培養條件優化培養基玉米粉2%、麥夫皮1%、酵母粉 0.5%、葡萄糖 1%、kh2p04 0. 1%. mgs04 0.05%、cac03 0. 2%、 維生素bl 1 mg/lo 固體菌種培養基小麥98%、白糖1%、石膏1%o小麥 在清水中浸泡68 h,吸足水分，然后煮熟（不開粒），撈 出瀝干水，加入石膏粉、白糖拌勻，分裝瓶中，滅菌，備用。 栽培培養基棉籽殼培養基（干料）：棉籽殼78%、麥夫 皮20%、蔗糖1%、caco3 1%,加水攪拌至含水量60%,裝袋 （每袋折合干料300 g）,滅菌，冷卻待用。1. 3

5、菌種活化菌種斜面接種到pda平板，25恒溫培養8 d,備用。1.4碳源、氮源的篩選每種不同培養基設置3個重復，用直徑0.2 cm的打孔 器在活化的菌種平板上打孔，搖瓶容量250 ml,裝液量70 ml, 接活化菌種5塊，25°c靜置24 h后，150 r/min搖瓶培養5 d,觀察菌絲球形態，測定菌絲體生物量。1.5菌絲體生物量測定取50 nil搖勻的培養液，過濾收集菌絲，蒸館水洗滌至 水變清后，將菌絲球置于恒重過的定性濾紙之上，于干燥箱 6（tc烘至恒重后稱量5。1.6液體菌種培養條件的優化 一級種子的制備將pda活化的菌種經打孔后接種到 液體培養基，恒溫25°c, 15

6、0 r/min條件下培養2 d,作為 種子備用。 搖瓶發酵條件的優化三角瓶容量250 ml,接種上述 種子液進行搖瓶發酵，根據已有報道57,以搖床轉速、 裝液量、接種量及培養溫度為4個因素，采用l9 （34）正交 試驗設計，詳見表1,共培養5 d,以菌絲體生物量為考察指標，進行培養條件優化, 獲得最佳搖瓶發酵培養條件。1. 7最佳接種菌齡的確定發酵培養基在最優條件下制備液體菌種，菌齡分別設4、 5、6 d三組，經輕微絞碎后，接種到棉籽殼培養基，每組 20袋，觀察菌絲長滿所耗的時間及菌絲的生長狀況。1.8固體菌種的制備將活化好的pda菌種平板接種到麥粒菌種培養基，在 25°c.相對濕度

7、75%左右條件下培養至滿袋后，繼續培養1 周，待用。1.9出菇試驗分別將固體和液體菌種（菌齡5d）接種10 g （或10 ml） 到棉籽殼培養基中，各50袋，24£、相對濕度75%左右條件 下培養至滿袋，繼續1周后轉入1314£菇房，相對濕度 85%90%,出菇兩茬8,記錄長滿、現蕾時間及鮮菇產量, 計算生物學效率，生物學效率（%）二子實體鮮質量/培養基 干質量x100%o2結果與分析2.1不同碳源對金針菇菌絲體生長的影響以不同碳源進行金針菇液體培養均能收獲菌絲，但所得 菌絲干質量差異較大（表2）。葡萄糖和蔗糖產生的菌絲體較 少，分別只有1. 136 2和1.051 1 g

8、/100 ml,而天然性的 碳源玉米粉和可溶性淀粉產生的菌絲體干質量較大，最多達 1. 630 5 g/100 ml,菌絲球的形態也較優。分析原因可能是 天然成分中含有有利于菌絲生長的生長因子，而葡萄糖可能 具有碳代謝抑制效應，形成反饋抑制作用，不利于碳源的吸 收與利用。2.2不同氮源對金針菇菌絲體生長的影響3種氮源中，nh4n03組獲得的菌絲干質量最少，只有0. 631 2 g/100 ml,說明nh4n03被真菌菌絲利用得很少， 在栽培過程中添加nh4n03的意義也不大；蛋白腺作為一種 半人工氮源，促進金針菇生長的作用表現一般；獲皮組中菌 絲的得率最高，達1.531 9 g/100 ml,

9、菌絲球的形態也最好, 這與現實應用中常以鉄皮作為輔助材料是一致的（表3）o 2.3搖瓶培養條件的優化 正交試驗結果對轉速、裝液量、接種量、培養溫度4 因素3水平的正交設計試驗優化結果見表4o極差分析表明, a>d>c>b,說明搖床轉速對液體菌種的菌體生長影響最大， 其次為培養溫度，再次為種子液的接種量，裝液量對菌絲得 率的影響最小。理論最優的培養條件為a2b2c3d2,即搖床轉速150 r/min.裝液量60 ml、接種量12%、培養溫度22°co 驗證性試驗 為了進一步檢驗正交試驗結果的可靠 性，按上述最優培養條件進行驗證試驗，3次重復，肉眼觀 察發現菌絲球大小較

10、均勻，濃度高，密度較大，經測定所得 菌絲干質量為1.821 5 g/100 mlo結果表明，在優化后的培 養條件下進行菌種液體培養具有較好的重復性，說明正交試 驗結果是可信的。2.4液體菌種的應用 最佳菌齡的確定分別將經過4、5、6 d發酵的液體 菌種接種到棉籽殼培養基上后，滿袋天數分別為27、25、28 d,其中發酵5 d的菌種滿袋所需時間最短，菌絲健壯，長 勢旺。 出菇試驗結果栽培試驗中2種不同菌種接種的菌袋 出菇過程的相關記錄見表5。液體菌種栽培袋長滿時間要比 固體菌種提早9 d,頭潮菇采收早7 d,二潮菇早9 d,總產 量約高出5. 8%o3小結與討論通過對不同碳源和氮源進行篩選，發現

11、以玉米粉為碳 源、魏皮為氮源制備金針菇21菌株液態菌種的效果較好。 在此基礎上進行培養條件的優化，發現當搖床轉速150 r/min.裝液量60 ml （三角瓶，250 ml容量）、接種量12%、 培養溫度221時所得液體菌種質量最優，菌絲干質量達 1.821 5 g/100 mlo該條件下生產的液體菌種在出菇試驗后 發現菌絲的生長時間、出菇時間都相應提前，有效地縮短了 生產周期，并且產量有所提高。碳源和氮源是食用菌最主要的營養物質，它們幾乎參與 細胞代謝一切的過程。金針菇能利用的碳源和氮源范圍很廣9,通常復合型的優于單一型的，有機態優于無機態。本 試驗篩選的結果顯示，較好的碳氮源分別是玉米粉和

12、鉄皮。 除了碳、氮源等主要營養元素外，包括無機鹽、生長因子等 其他營養成分對金針菇的生長發育的影響也十分明顯，不少 研究者作了很多工作5, 9。不同菌株特異性不同，所以在 營養需求上略有差異，有必要從實驗室研究10和栽培實踐 7, 11兩方面協同深入。液體菌種的培養條件中溫度是相對較為敏感的因素，有 研究者發現25£是金針菇液體菌種的最適培養溫度6, 11, 本試驗發現最適溫度為22°c,與黃仁術5的結果一致。本 試驗優化后的最優轉速與陳力力等6和閆長偉等7的結 果略有差異，極差分析顯示，轉速對菌種的影響最大，分析 原因可能是正交設計的轉速差距較大造成的。搖瓶培養過程 中，

13、較高轉速通常會導致菌絲球過于緊密，限制其生長，從 而影響菌絲生物量，相反，轉速過低又會影響營養物質的傳 導和溶氧量，不利于生物量的積累和菌絲活力的保持。目前, 生產實踐中，多采用發酵罐液體深層發酵，與搖瓶不同的是 需要考察螺旋槳11對菌絲的剪切力和通氣量10, 12等指 標，較搖瓶發酵更為精確。由于出菇試驗是小規模袋式栽培，管理過程中參數波動 幅度較大13,導致兩組試驗總體的生物轉化率都偏低。另 外，搖瓶發酵的液體菌種菌絲活力會略遜于液體深層發酵， 使得液體菌種的優勢發揮也不充分。所以，出菇試驗的結果 只是在一定程度上說明了液體菌種在栽培上有優勢，在生產 實踐上的應用有待進一步細致深入的分析。

14、參考文獻1 魏華金針菇的營養保健作用j食用菌學報,1995, 2 (1)： 59-64.2 黃年來.中國最有開發前景的主要藥用真菌j.食 用菌，2005, 27 (1)： 3-4.3 王澤生國內外食用菌產業現狀與發展趨勢a. / 中國菌物產業與科技研討會論文集c, 2005： 7-15.4 黃毅食用菌工廠化設施栽培的問題與對策j.食 用菌，2003, 25 (6)： 2-4.5 黃仁術金針菇液體培養營養需求及培養條件研究 j食品工業科技，2006, 27 (12)： 89-91 6 陳力力，劉紅，鄒正金針菇液體菌種的制備及栽 培試驗j食用菌,2011, 33 (2)： 13-14.7 閆長偉，陳合，陳宜鼎金針菇液體菌種篩選及培 養條件的研究j中國食用菌，2003, 22 (1)： 35-37.8 李國元金針菇的優質栽培技術j 長江蔬菜，1999 (11)： 40-41.9杜世，黨阿麗，王鳳云金針菇菌絲生長的營養 需求及液體發酵研究j.微生物學通報，1997, 24 (3)： 134-137.10江玉姬，謝