1、電鏡觀察樣品時應注意電鏡觀察樣品時應注意的幾個問題的幾個問題 一、對觀察內容的初步鑒定一、對觀察內容的初步鑒定 低放大倍數下（低放大倍數下（3000倍），根據細倍），根據細胞的形態和輪廓、細胞內和細胞間物質胞的形態和輪廓、細胞內和細胞間物質的伸延情況基本上可對組織類型做出初的伸延情況基本上可對組織類型做出初步判斷。步判斷。 二、正確使用放大倍數二、正確使用放大倍數 一般對組織的觀察，從低倍開始；一般對組織的觀察，從低倍開始；觀察病毒在觀察病毒在2-3萬倍以上，觀察大分子結萬倍以上，觀察大分子結構要構要10萬倍以上。萬倍以上。 三、局部與整體三、局部與整體 通觀全局，避免片面性。一個細胞的超通觀

2、全局，避免片面性。一個細胞的超薄切片只是一個細胞的薄切片只是一個細胞的1/100-1/500。觀察時觀察時現場記錄；典型的代表性結構需攝片；經常現場記錄；典型的代表性結構需攝片；經常需設對照組；觀察時需設對照組；觀察時2-3人為宜，對重要發現人為宜，對重要發現要相互核實。要相互核實。 四、形態與功能四、形態與功能 例如，腎衰時，尿中鈉離子增高，近曲例如，腎衰時，尿中鈉離子增高，近曲小管上皮細胞變性。小管上皮細胞變性。 五、動與靜的對立統一五、動與靜的對立統一 肝細胞壽命肝細胞壽命-18個月個月 紅細胞壽命紅細胞壽命-120天，每人每天天，每人每天平均死亡一千幾百億紅細胞平均死亡一千幾百億紅細胞

3、 消化管內壁細胞壽命消化管內壁細胞壽命-幾十小幾十小時時 細胞發育早、中、晚期，機體發育細胞發育早、中、晚期，機體發育幼年、青年、壯年、老年幼年、青年、壯年、老年六、人工損傷及其識別六、人工損傷及其識別 1、標本制作中人工損傷標本制作中人工損傷 固定損傷固定損傷:延誤固定時間，固定液延誤固定時間，固定液 滲透壓滲透壓 包埋損傷包埋損傷 超薄切片損傷超薄切片損傷:刀痕，顫痕刀痕，顫痕 玷污玷污:鉛污染鉛污染 2、電子束轟擊電子束轟擊七、電鏡技術及其它先進技術結合七、電鏡技術及其它先進技術結合 1、與中醫相結合與中醫相結合 2、與免疫電鏡、細胞化學、能譜與免疫電鏡、細胞化學、能譜相結合相結合掃描探

4、針顯微鏡及其在掃描探針顯微鏡及其在生物醫學中的作用生物醫學中的作用掃描探針顯微鏡及其在掃描探針顯微鏡及其在生物醫學中的應用生物醫學中的應用 醫學的每一步前進必然建立在科技發展的基醫學的每一步前進必然建立在科技發展的基礎上，如礎上，如18581858年開始的光學顯微鏡觀察使對疾病年開始的光學顯微鏡觀察使對疾病的認識到達了細胞水平，的認識到達了細胞水平，19501950年出現的電子顯微年出現的電子顯微鏡把對疾病的認識提高到了亞細胞水平。鏡把對疾病的認識提高到了亞細胞水平。 當代醫學的發展已經到達了分子生物學廣泛當代醫學的發展已經到達了分子生物學廣泛應用的時代，人們迫切需要對分子水平的結構、應用的時

5、代，人們迫切需要對分子水平的結構、形態進行直接的觀察，掃描探針顯微鏡形態進行直接的觀察，掃描探針顯微鏡（SPMSPM）的問世正是滿足了這一要求。的問世正是滿足了這一要求。 雖然電子顯微鏡的發明大大提高了成像分雖然電子顯微鏡的發明大大提高了成像分辨率，但苛刻的樣品制備條件容易改變生物分辨率，但苛刻的樣品制備條件容易改變生物分子的天然結構；另外，高真空狀態的成像偏離子的天然結構；另外，高真空狀態的成像偏離生物分子生理環境太遠，使我們很難獲得生物生物分子生理環境太遠，使我們很難獲得生物分子的真實結構信息和反應過程。應用分子的真實結構信息和反應過程。應用SPMSPM觀觀察物體可達到察物體可達到1010

6、8 8mm，并可直接對標本進行觀，并可直接對標本進行觀察，應用范圍之廣出乎人們的意料，其潛在的察，應用范圍之廣出乎人們的意料，其潛在的巨大作用正在被開發。巨大作用正在被開發。 SPMSPM主要類型有：掃描隧道顯微鏡主要類型有：掃描隧道顯微鏡（STMSTM）、原子力顯微鏡（）、原子力顯微鏡（AFMAFM）、掃描力顯）、掃描力顯微鏡（微鏡（SFMSFM）、掃描磁顯微鏡（）、掃描磁顯微鏡（SMMSMM）等，隨）等，隨著著SPMSPM領域的新技術的高速發展，還會有新的領域的新技術的高速發展，還會有新的型號出現，但其基本原理是建立在量子力學和型號出現，但其基本原理是建立在量子力學和壓電材料技術上的。壓電

7、材料技術上的。掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡 掃描隧道顯微鏡掃描隧道顯微鏡（STMSTM）是根據量子是根據量子力學的電子隧道效應設計的。力學的電子隧道效應設計的。 當針尖（探針）與樣品表面距離小當針尖（探針）與樣品表面距離小于于1nm1nm以下時，針尖電子云與樣品表面電以下時，針尖電子云與樣品表面電子云重疊子云重疊-加上微小電壓加上微小電壓（2mV-2V2mV-2V）-針尖和樣品間產生隧道電流針尖和樣品間產生隧道電流樣 品+ + +V(2mV-2V)+L1nm 針尖到樣品表面原子的距離與隧道針尖到樣品表面原子的距離與隧道電流成指數關系，所以間距的變化對隧電流成指數關系，所以間距的變化對隧道電流的

8、反應是十分敏感的。當針尖在道電流的反應是十分敏感的。當針尖在樣品表面掃描時，間距則隨樣品表面起樣品表面掃描時，間距則隨樣品表面起伏不平的形貌而變化著，因而隧道電流伏不平的形貌而變化著，因而隧道電流也隨之變化著。記錄變化的隧道電流，也隨之變化著。記錄變化的隧道電流，則可獲得樣品表面的形貌特征，達到觀則可獲得樣品表面的形貌特征，達到觀察樣品表面原子結構圖像的目的。但是察樣品表面原子結構圖像的目的。但是它要求被觀察的樣品必須具有導電性，它要求被觀察的樣品必須具有導電性，因此對生物樣品的觀察就受到限制。因此對生物樣品的觀察就受到限制。原子力顯微鏡原子力顯微鏡 原子力顯微鏡（原子力顯微鏡（AFMAFM）

9、的發明是建立在掃）的發明是建立在掃描隧道顯微鏡的基礎上的，利用對微弱力極其敏描隧道顯微鏡的基礎上的，利用對微弱力極其敏感、頂端帶針尖的微懸臂對樣品表面進行逐行掃感、頂端帶針尖的微懸臂對樣品表面進行逐行掃描，針尖最外層原子與樣品表面原子之間的相互描，針尖最外層原子與樣品表面原子之間的相互作用力使微懸臂發生形變或者改變運動狀態，通作用力使微懸臂發生形變或者改變運動狀態，通過檢測微懸臂的偏轉獲得樣品形貌和作用力等相過檢測微懸臂的偏轉獲得樣品形貌和作用力等相關信息供計算機成像。因此，關信息供計算機成像。因此，AFMAFM不要求樣品不要求樣品具有導電性，待測樣品不需要特殊處理就可以直具有導電性，待測樣品

10、不需要特殊處理就可以直接進行納米尺度的觀測。接進行納米尺度的觀測。AFMAFM在液態環境中也在液態環境中也可成像，而且針尖對樣品表面的接觸作用力較小，可成像，而且針尖對樣品表面的接觸作用力較小，能避免對樣品造成大的損傷，所以能避免對樣品造成大的損傷，所以AFMAFM成為對成為對自然狀態下的細胞、生物大分子等進行納米尺度自然狀態下的細胞、生物大分子等進行納米尺度實時觀測的有效工具。實時觀測的有效工具。生物樣品標本制備生物樣品標本制備 一般生物標本在常壓、液態環境中可直接一般生物標本在常壓、液態環境中可直接觀察。觀察。 培養細胞：取培養在玻片上的細胞，用培養細胞：取培養在玻片上的細胞，用PH7.4

11、PH7.4的的PBSPBS緩沖液洗，緩沖液洗，1.5%1.5%戊二醛固定戊二醛固定5 5分鐘，分鐘，蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗3 3次，干燥，次，干燥，AFMAFM觀察。觀察。 生物樣品超薄切片法：標本在冰凍的生物樣品超薄切片法：標本在冰凍的2%2%戊戊二醛固定后，經過二醛固定后，經過0.1mol/l PBS0.1mol/l PBS緩沖液沖洗，乙緩沖液沖洗，乙醇梯度脫水，環氧丙烷中過夜，環氧樹脂包埋，醇梯度脫水，環氧丙烷中過夜，環氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片撈在新解離的云母上，半薄切片定位，超薄切片撈在新解離的云母上，干燥后用干燥后用AFMAFM在空氣中進行觀察。在空氣中進行觀察。應應 用用

12、AFMAFM對細胞膜表面研究分為：第一階對細胞膜表面研究分為：第一階段是對大量的細胞膜表面（包括細胞內、段是對大量的細胞膜表面（包括細胞內、外表面）外貌、粘度、硬度、彈性、力學外表面）外貌、粘度、硬度、彈性、力學等信息的觀測。第二階段是對膜表面的標等信息的觀測。第二階段是對膜表面的標記物（如抗體）和作用物（如藥物和甾體記物（如抗體）和作用物（如藥物和甾體物質）的觀察。第三階段對信息傳導、細物質）的觀察。第三階段對信息傳導、細胞連接、細胞膜表面生化反應等的研究。胞連接、細胞膜表面生化反應等的研究。目前研究主要處于前兩個階段。目前研究主要處于前兩個階段。 AFMAFM在核酸及其蛋白質復合物結構在核

13、酸及其蛋白質復合物結構研究中的應用已日趨廣泛。為了提高研究中的應用已日趨廣泛。為了提高AFMAFM成像分辨率、保證所獲得結果的可靠性和成像分辨率、保證所獲得結果的可靠性和再現性，必須重視再現性，必須重視DNADNA樣品的制備過程。樣品的制備過程。成像成像DNADNA分子時，選擇合適的針尖、合分子時，選擇合適的針尖、合適的成像方式、合適的成像環境，減小針適的成像方式、合適的成像環境，減小針尖和尖和DNADNA分子間的力作用，都有利于提分子間的力作用，都有利于提高成像質量。高成像質量。評評 價價 AFM AFM的被測樣品無需進行復雜的處理，對的被測樣品無需進行復雜的處理，對成像環境也沒有什么特別要

14、求，保證了所觀察的成像環境也沒有什么特別要求，保證了所觀察的樣品表面結構的真實性。由于樣品表面結構的真實性。由于AFMAFM針尖采集的表針尖采集的表面結構圖可在掃描過程中以三維形式直接顯示到面結構圖可在掃描過程中以三維形式直接顯示到計算機屏幕上，因此可以定量分析被檢測樣品的計算機屏幕上，因此可以定量分析被檢測樣品的空間構像，這一特點是目前已有的其他顯微技術空間構像，這一特點是目前已有的其他顯微技術無法比擬的。無法比擬的。 雖然雖然SPMSPM問世才短短問世才短短1010年，但其在生物醫學年，但其在生物醫學上應用的巨大潛力已經明示在我們面前，上應用的巨大潛力已經明示在我們面前，SPMSPM的的廣

15、泛應用使我們進入到疾病的原子水平的認識上，廣泛應用使我們進入到疾病的原子水平的認識上，提高醫學基礎科研水平，為臨床發展提供動力和提高醫學基礎科研水平，為臨床發展提供動力和線索。線索。電子顯微學在結構生物學電子顯微學在結構生物學研究中的新進展研究中的新進展電子顯微學在結構生物學電子顯微學在結構生物學研究中的新進展研究中的新進展 電子顯微學是結構生物學的重要分支，已電子顯微學是結構生物學的重要分支，已經成為一種公認的研究生物大分子、超分子復經成為一種公認的研究生物大分子、超分子復合體及亞細胞結構的有力手段。合體及亞細胞結構的有力手段。 半個多世紀以來電子顯微學的奮斗目標主半個多世紀以來電子顯微學的

16、奮斗目標主要是力求觀察更微小的物體結構、更細小的實要是力求觀察更微小的物體結構、更細小的實體、甚至單個原子，并獲得有關試樣的更多的體、甚至單個原子，并獲得有關試樣的更多的信息，以便對材料、生物樣品的顯微結構進行信息，以便對材料、生物樣品的顯微結構進行綜合分析。綜合分析。透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡 高分辨電子顯微學高分辨電子顯微學（ HREM ）及原子像的觀察及原子像的觀察 像差校正電子顯微鏡像差校正電子顯微鏡 原子尺度電子全息學原子尺度電子全息學 表面的高分辨電子顯微正面成像表面的高分辨電子顯微正面成像 超高壓電子顯微鏡超高壓電子顯微鏡 中等電壓中等電壓（200kV,300kV）電子顯微鏡電

17、子顯微鏡 分析電子顯微鏡分析電子顯微鏡（120kV,100kV） 場發射槍掃描透射電子顯微鏡場發射槍掃描透射電子顯微鏡 能量選擇電子顯微鏡能量選擇電子顯微鏡 美國美國GATAN公司的電子能量選擇成公司的電子能量選擇成像系統裝在投影鏡后方，可對電子能量像系統裝在投影鏡后方，可對電子能量損失譜選擇成像。可在幾秒鐘內實現在損失譜選擇成像。可在幾秒鐘內實現在線的數據讀出、處理、輸出、及時了解線的數據讀出、處理、輸出、及時了解圖像的質量，據此自動調節有關參數，圖像的質量，據此自動調節有關參數，完成自動合軸、自動校正像散和自動聚完成自動合軸、自動校正像散和自動聚焦等工作。焦等工作。 透射電鏡經過了半個多世

18、紀的發展已接近透射電鏡經過了半個多世紀的發展已接近或達到了由透鏡球差和衍射差所決定的或達到了由透鏡球差和衍射差所決定的0.10.2nm的理論分辨本領。人們正在探索進一步的理論分辨本領。人們正在探索進一步消除透鏡的各種像差，研究新的像差校正法，消除透鏡的各種像差，研究新的像差校正法，進一步提高電磁透鏡和整個儀器的穩定性；采進一步提高電磁透鏡和整個儀器的穩定性；采用并進一步發展高亮度電子源場發射電子槍，用并進一步發展高亮度電子源場發射電子槍，X射線譜儀和電子能量選擇成像譜儀，慢掃描射線譜儀和電子能量選擇成像譜儀，慢掃描電荷耦合器件電荷耦合器件CCD，冷凍低溫和環境試樣室，冷凍低溫和環境試樣室，納米量級的會聚束微衍射，原位實時分析，全納米量級的會聚束微衍射，原位實時分析，全數字控制，圖像處理與現代信息傳送技術實現數字控制，圖像處理與現代信息傳送技術實現遠距離操作觀察，以及克服試樣本身帶來的各遠距離操作觀察，以及克服試樣本身帶來的各種限制，透射電鏡正面臨著一個新的重大突破。種限制，透射電鏡正面臨著一個新的重大突破。掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡 分析掃描電鏡和分析掃描電鏡和X X射線能譜儀射線能譜儀（EDS） 、X X射線射線波譜儀波譜儀（WD