1、生化工程生化工程Biochemical EngineeringAir-lift internal cross-flow bioreactor(30,150L)pilot plant工業規模的氣升式反應器工業規模的氣升式反應器Sensors and probespH probeMettler ToledoMETTLER TOLEDO Process Analytics is specialized on the parameters pH, DO, conductivity, turbidity and CO2 with a wide range of high quality products

2、 as sensors.http:/Biomass monitor 220(Aber, UK)不分光紅外不分光紅外CO2分析儀分析儀 磁壓氧分析儀磁壓氧分析儀 發酵過程檢測的參數發酵過程檢測的參數溫度溫度. .細胞生長細胞生長罐壓罐壓. .溶解氧溶解氧 正壓正壓空氣流量空氣流量. .供養供養攪拌轉速攪拌轉速. .混合傳質混合傳質黏度黏度 . .菌體生長菌體生長裝液量裝液量. .發酵液性質發酵液性質濁度濁度 . .細胞生長細胞生長物理常數物理常數泡沫，加消泡劑速率，加酸堿速率，補料速率泡沫，加消泡劑速率，加酸堿速率，補料速率發酵過程化學常數發酵過程化學常數酸堿度酸堿度溶解氧溶解氧尾氣尾氣O2尾氣

3、尾氣CO2氧化還原電位氧化還原電位總糖，葡萄糖，蔗糖總糖，葡萄糖，蔗糖前體濃度前體濃度發酵過程生物學常數發酵過程生物學常數 菌體濃度菌體濃度 菌體菌體RNA DNA 菌體菌體ATP ADM AMP 菌體菌體NADH 產物濃度產物濃度 細胞形態細胞形態 pH傳感器傳感器能夠進行原位滅菌的復合能夠進行原位滅菌的復合pH傳感器傳感器 （梅特勒）（梅特勒）探頭：探頭： 產生電壓型號的電產生電壓型號的電化學原件，玻璃膜化學原件，玻璃膜 DO 溶解氧傳感器溶解氧傳感器一般采用覆膜式溶氧探頭，測定氧分壓一般采用覆膜式溶氧探頭，測定氧分壓特點：特點：不銹鋼探頭不銹鋼探頭透氣性膜透氣性膜電解液電解液生物反應過程

4、上游加工過程加工過程下游成本經濟學原料的生物具有應用價值傳統育種基因工程細胞工程目的產物大規模工藝開發設計思想遺傳學生理學工業發酵過程：承上啟下發酵過程控制與最優化技術在發酵工程中的重要地位發酵過程控制與最優化技術在發酵工程中的重要地位發酵技術研究過程：關鍵工程技術發酵過程的檢測、控制、與最優化系統GlucosePyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP微生物細胞在發酵過程中生長和代謝始終處于最佳狀態發酵過程控制與最優化的目標發酵過程控制與最優化的目標稀溶液特征 高產量 便于下游處理糧食原料為底物 高轉化率 降低原

5、料成本分批操作為主 高生產強度 縮短生產周期發酵過程經濟性、科學性顯著提高！高產量高底物轉化率高生產強度相對統一 發酵過程控制的特征發酵過程控制的特征生物的自我調節、環境壓力下的適應能力生物的自我調節、環境壓力下的適應能力發酵過程的易受控制特征是其相當長的時間常數發酵過程的易受控制特征是其相當長的時間常數 前饋控制策略前饋控制策略 發酵監測儀器發酵監測儀器 （RQ, 黏度。）黏度。）補料分批培養補料分批培養葡萄糖生物傳感器，在線葡萄糖葡萄糖生物傳感器，在線葡萄糖FIA法監測，近紅外測法監測，近紅外測定甘油，定甘油， 在線氣相色譜監測甲醇在線氣相色譜監測甲醇 發酵過程控制的主要常數發酵過程控制的

6、主要常數1. 生理特性數據生理特性數據 （RQ 呼吸商）呼吸商）酵母 RQ代謝途徑1.0以上積累乙醇10.9氧化生長0.80.7內源呼吸0.6一下乙醇被利用酵母呼吸商與代謝途徑關系酵母呼吸商與代謝途徑關系計算機對發酵過程生理特征測定與控制圖計算機對發酵過程生理特征測定與控制圖2. 發酵過程的生化特性數據發酵過程的生化特性數據3. 發酵過程的物理數據發酵過程的物理數據 發酵過程的主要控制策略發酵過程的主要控制策略1、發酵過程的、發酵過程的PID控制控制PID控制：控制： 調節器控制調節器控制 比例積分微分控制比例積分微分控制2、發酵過程的推理控制、發酵過程的推理控制利用過程模型由可測輸出變量將不

7、可測的被控制過程利用過程模型由可測輸出變量將不可測的被控制過程的輸出變量推算出來，實現反饋控制，或者將不可測的輸出變量推算出來，實現反饋控制，或者將不可測擾動推算出來，以實現前饋控制的一種控制系統。擾動推算出來，以實現前饋控制的一種控制系統。S 系統設定值，系統設定值， u 控制動作控制動作 v 系統次級輸出系統次級輸出 y 系統初級輸出系統初級輸出3、發酵過程的適應性（預估）控制、發酵過程的適應性（預估）控制利用適應性控制器替代利用適應性控制器替代 PID回路，但是比較復雜回路，但是比較復雜4. 發酵過程非線性控制發酵過程非線性控制Bastin： 輸入輸出線性化控制法則輸入輸出線性化控制法則

8、LIU： 基于神經網絡的非線性自適應控制策略基于神經網絡的非線性自適應控制策略 用于發酵監督與控制的知識庫系統（專家庫）用于發酵監督與控制的知識庫系統（專家庫）特點：能應付不確定的事務，以啟發式方法，給定量和定特點：能應付不確定的事務，以啟發式方法，給定量和定性或符號表達來再現訓練有素的過程操作人員的操作。性或符號表達來再現訓練有素的過程操作人員的操作。實時專家系統軟件實時專家系統軟件: BioSCAN (bioprocess supervision control and analysis)實例-丙酮酸發酵的分階段溶解氧控制策略 0 4 8 12 16 t / h (DCW) / (g/L)

9、 A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h (Glucose) / (g/L) B 0 0.2 0.4 0.6 0.8 t / h / h-1 1 2 3 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h (Pyruvate) / (g/L) C 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 t / h 1 2 3 E 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 t / h 1 2 3 F qs / h-1 qp / h-1 D 不同不同kLa下發酵過程動力學曲線下發酵過程動力學曲線 高高kLa

10、下，下，丙酮酸產率丙酮酸產率較高較高，但葡但葡萄糖消耗速萄糖消耗速度較慢度較慢。 低低kLa 下，下，葡萄糖消耗葡萄糖消耗速度加快速度加快，然而丙酮酸然而丙酮酸產率卻明顯產率卻明顯下降。下降。恒定恒定kLa發酵過程中不同階段的碳平衡發酵過程中不同階段的碳平衡分階段供氧控制模式分階段供氧控制模式發酵0-16 h控制kLa為450 h-1，16 h后將kLa降低至200 h-1 實現了實現了高產量高產量(69.4 g/L)、高產率高產率(0.636 g/g)和高葡萄糖消耗速和高葡萄糖消耗速度度(1.95 g/(L h)的的相對統一相對統一。 生產強度生產強度(1.24 g/(L h)比比kLa恒定

11、為恒定為450、300和和200 h-1的的分批發酵過程分別分批發酵過程分別提高了提高了36%、23%和和31%。分階段供氧控制模式下的發酵研究分階段供氧控制模式下的發酵研究不同供氧控制模式下發酵過程參數比較不同供氧控制模式下發酵過程參數比較2基于代謝網絡模型的發酵過程在線控制和優化基于代謝網絡模型的發酵過程在線控制和優化利用現存的生物化學理論，確立特利用現存的生物化學理論，確立特定發酵過程的代謝網絡模型定發酵過程的代謝網絡模型依據在線推定的結果，對發酵過程進行在線控制和優化求解（在線推定）不同操作條件下不可求解（在線推定）不同操作條件下不可測、著眼物質的濃度和生成模式測、著眼物質的濃度和生成

12、模式在線測定常見、易測的狀態變量的在線測定常見、易測的狀態變量的速度參數（如速度參數（如CO2生成速度）生成速度）通用性強、模型意義明確、建通用性強、模型意義明確、建模相對容易。全新的控制模式模相對容易。全新的控制模式通用于主要代謝途徑已為人們所知、通用于主要代謝途徑已為人們所知、以氨基酸、有機酸等為代表的、大以氨基酸、有機酸等為代表的、大宗發酵產品的生產宗發酵產品的生產實例基于代謝網絡模型的谷氨酸發酵在線狀態預測谷氨酸發酵產酸期代謝網絡和反應谷氨酸發酵產酸期代謝網絡和反應GlucoseATPADPGlu6PFru6Pr1r2G3PATPADPADPATPNADNADHr3r5PYRRespi

13、ratory Chain &Oxidative PhosphorylationADPATPO2NADHr18Pir19ADPLactateNADHNADNADPNADPHr4r9EMPPP PathwayCO2NADNADHCO2Ac-CoACO2r6PEPATPNADPHNADHIsocit KGSucMalOaANADCO2NH3NADPHGlutamateADPATPNADNADHCO2FAD2/3NADHNADNADHGlyoxyr10r11r13r14r16r17r17r15r7r8r12r20TCAADPADPATPO2NADHEMP Glycolysis Pathwayr

14、1: Glucose + ATP = Glu6P + ADPr2: Glu6P = Fru6Pr3: Fru6P + ATP = 2 G3P + ADPr5: G3P + NAD +ADP = PEP + ATP + NADHr6: PEP + ADP = PYR + ATP PP Pentose Phosphate Pathway r4: 3 Glu6P + 6 NADP = 2 Fru6P + G3P + 6 NADPH + 3 CO2 TCA Cycler7: PEP + CO2 + ATP = OaA + ADPr9: PYR + NAD = Ac-CoA + NADH + CO210

15、: Ac-CoA + OaA = Isocitr11: Isocit + NAD = KG + NADH + CO2r13: KG + NAD + ADP = Suc + NADH + ATP +CO2r14: Suc + FAD = Mal + 2/3 NADHr15: Mal + NAD = OaA + NADH Glyoxylate Shuntr16: Isocit = Suc + Glyoxyr17: Ac-CoA + Glyoxy =Mal Metabolic Products Formationr8: PYR + NADH = Lactate + NADr12: KG + NH3

16、+ NADPH = Glutamate + NADP Respiratory Chain & Oxidative Phosphorylationr18: O2 + 2 NADH + 2(P/O) ADP = 2(P/O) ATP + 2 NAD + 2 H2Or19: ATP = ADP + Pir20: O2 + 2(1+) NADPH + 2 NAD = 2 NADH + 2(1+) NADP + 2H2O研究實例基于代謝網絡模型的谷氨酸發酵在線狀態預測代謝網絡模型有效性和通用性在谷氨酸發酵中的驗證0204060010203040Time (h)Glutamate Conc. (g

17、/L)0510NH4+ & KetoglutarateConc. (g/L)(c)0204060800102030Time (h)Glutamate Conc. (g/l)0306090DO (%)(b)020406080010203040Time (h)Glutamate Conc. (g/l)DO=10%DO=30%(a)020406005101520Time (h)Glutamate & LactateConc. (g/L)03060DO (%)(a)谷氨酸谷氨酸乳酸乳酸谷氨酸谷氨酸 -酮戊二酸酮戊二酸NH4-基于代謝網絡模型的發酵過程在線控制和最優化技術在線最優化控制策

18、略01020304050010203040Time (h)Lactate Conc. (g/L)(b)020406080010203040Time (h)Glutamate Conc. (g/l)050100150200OUR (mol/m3h)OUR, DO10%OUR, DO50%谷氨酸谷氨酸乳酸乳酸DO=50%DO=10%DO=50%DO=10%LLsetsetsetDODOLKRkDOkDO)()() 1(*物理意義物理意義盡量降低盡量降低DO水平，保持細胞產谷氨酸的生理活性；而當水平，保持細胞產谷氨酸的生理活性；而當DO對對乳酸積累的增益乳酸積累的增益K的值過大時（乳酸嚴重積累），則

19、提高的值過大時（乳酸嚴重積累），則提高DO的控制水平。的控制水平。*增益增益K可以利用可以利用DO和（在線推定得到的）乳酸濃度時間序列數據，用最小和（在線推定得到的）乳酸濃度時間序列數據，用最小二乘回歸迭代法加以確定二乘回歸迭代法加以確定自回歸移動平均模型（自回歸移動平均模型（ARMA） 。3 3基于智能識別模型的流加培養過程在線控制基于智能識別模型的流加培養過程在線控制在線測定培養液中在線測定培養液中DODO、pHpH等最易等最易測量的狀態變量的時間變化測量的狀態變量的時間變化依據在線生理狀態的識別結果確定基質最優流加策略、實依據在線生理狀態的識別結果確定基質最優流加策略、實現微生物高密度培

20、養、和相應遺傳產物的高效表達。現微生物高密度培養、和相應遺傳產物的高效表達。 利用人工神經網絡（利用人工神經網絡（ANN）技術在線識別培養過程所處的生理狀態技術在線識別培養過程所處的生理狀態DODO和和pHpH時間變化模式與流加培養時間變化模式與流加培養過程生理狀態存在一一對應關系過程生理狀態存在一一對應關系通用性強、生理意義明確、通用性強、生理意義明確、僅需測定僅需測定DO和和pH（或（或RQ）。）。全新的控制模式全新的控制模式通用于基因重組大腸桿菌、酵母等微生物通用于基因重組大腸桿菌、酵母等微生物高密度流加培養系統，表達生產具有高附高密度流加培養系統，表達生產具有高附加值的醫藥品或生物酶的

21、發酵過程加值的醫藥品或生物酶的發酵過程大腸桿菌流加培養過程中大腸桿菌流加培養過程中DODO和和pHpH變化模式與生理狀態的對應關系變化模式與生理狀態的對應關系02550751000510時間（h）溶解氧濃度（%）8.20510時間（h）pH（-）212 12 121bca cacac03060901201500510時間(h)OD620(-)/葡萄糖濃度(g/L)010203050070090011000510時間(h)基質罐重量(g)圖-2，使用原生大腸桿菌 k12 的基礎實驗。1：DO 振動；2：DO 非振動。a：pH 下限振動；b：pH 不振動；c：pH 上限振動。：細

22、胞濃度（OD620）：葡萄糖濃度。 DODO變化模式：變化模式：1 1）振動）振動2 2）非振動）非振動pHpH變化模式：變化模式：1 1）“高位高位”振動振動2 2）“低位低位”振動振動3 3）不振動）不振動狀態狀態I I：基質過量；狀態基質過量；狀態IIII：基質匱乏；基質匱乏； 狀態狀態IIIIII：基質濃度適中；基質濃度適中；狀態狀態IVIV：矛盾狀矛盾狀態。態。不同的DO和pH的變化模式組合代表了不同的生理狀態實例實例DODO時間變化模式的人工神經網絡在線識別模型時間變化模式的人工神經網絡在線識別模型以以DO-Stat法為手段，生成法為手段，生成DO時間變化的基本模式時間變化的基本模

23、式的實驗數據，并在此基礎上刻意地施加一定規模的的實驗數據，并在此基礎上刻意地施加一定規模的人工模擬信號。得到可覆蓋所有可能出現的模式、人工模擬信號。得到可覆蓋所有可能出現的模式、通用型的通用型的ANN在線識別模型。在線識別模型。將所有時間變將所有時間變化模式數據提化模式數據提供給供給ANN進行進行大規模的學習大規模的學習訓練。輸出層訓練。輸出層輸出單元輸出單元O(3)=O1(3),O2(3)為為1,0時代時代表振動，表振動，0,1代表非振動。代表非振動。實例實例人工神經網絡人工神經網絡(ANN)在線識別模型的識別結果在線識別模型的識別結果利用利用ANN模型的模型的E.coli B流加培養溶氧濃

24、度時間變化模式識別的結果流加培養溶氧濃度時間變化模式識別的結果 實例實例依據在線識別結果的基質最優流加控制策略依據在線識別結果的基質最優流加控制策略E.coli 流加培養中、依據流加培養中、依據DO和和pH時間變化模式的狀態判定和基質流加控制策略時間變化模式的狀態判定和基質流加控制策略 DO 振動振動 MaxFkFkFkFkFTkFkF)(0)()()()1 () 1()(*流加主泵的調節方式流加主泵的調節方式基質濃度調節的控制框圖基質濃度調節的控制框圖依據模式識別結果確定過程所處的生理狀態，并確定主泵調節方向反饋控制器反饋控制器（輔流加泵）（輔流加泵）主流加泵主流加泵發酵罐發酵罐(過程）過程

25、）DO, pHDO,pH設定值設定值DO, pHDO模式識別器模式識別器pH模式識別器模式識別器過程狀態識別器過程狀態識別器F* FF5在某些生物反應過程中，僅對反應單元進行優化難以取得理想效果。將生物反應視為一個系統，從優化系統內部各要素的功能和相互間的關系、系統與環境的關系入手使系統的結構、性能和狀態達到最優 CO2+H2O +Organic acid(Ethanol) Precursor ATP ADP or AMP Glucose Product Regenerate ATP Demand ATP E.coliBrevibacterium ammoniagenesS.cerevisia

26、e計算機模擬的主要計算機模擬的主要結論：結論：*提高基質流加濃度是提高基質流加濃度是增強丁醇增強丁醇-丙酮生產強丙酮生產強度的最優途徑；度的最優途徑；*提高萃取相流速可以提高萃取相流速可以加大生產強度，但必加大生產強度，但必須要以大量增加能耗須要以大量增加能耗為代價；為代價；*采用兩塔閃蒸的方法采用兩塔閃蒸的方法不可能滿足產品純度不可能滿足產品純度要求（純度要求（純度 95%），），塔塔1必須要使用必須要使用2塊塔塊塔板以上的真空蒸餾；板以上的真空蒸餾；塔塔1的塔板數和回流比的塔板數和回流比控制在控制在2-3和和1.0-3.0間間為佳。為佳。6發酵過程在線檢測關鍵技術的研究與開發發酵過程在線檢

27、測關鍵技術的研究與開發乳酸葡萄糖谷氨酸尿素？兩者間的連兩者間的連接是關鍵接是關鍵1 1、高溫滅菌、高溫滅菌2 2、多參數時變性多相反應過程、多參數時變性多相反應過程體系體系1 1、線性范圍窄、線性范圍窄2 2、檢測環境條件苛求穩、檢測環境條件苛求穩定定3 3、穩定性較差，易受干、穩定性較差，易受干擾和失活擾和失活原位微量取樣器的研制原位微量取樣器的研制取樣探頭由探頭園柱體（1）、膜過濾件（2）、膜外導流夾套（3）、導流接插件（4）、引出管（5）、套管（6）組成。 膜過濾件（2）采用陶瓷膜件，膜件為管狀，膜層在內壁，支撐層在外，內徑為6-10mm，外徑為10-14mm。膜件長8-12mm，膜孔徑0.1-0.2m。 在夾套（3）內壁做成螺紋狀，用于導流，螺紋大徑和小徑之差小于2mm。 V =0.358ml2V =0.059ml1V=