1、果酒酵母的分離純化及選育果酒是利用新鮮水果為原料，在保存水果原有營養成分的情況下，利用自然發酵或人工添加酵母菌來分解糖分而制造出的具有保健、營養型酒。果酒富含多種氨基酸、維生素及礦物質等營養成分，還含有豐富的生理活性物質，經常適量飲用具有一定的保健作用。酵母品種是釀造果酒的關鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風味，決定果酒品質的優劣。果酒酵母包括醇釀酒酵母和非釀酒酵母，前者的應用提高了果酒釀造的生產效率，后者的應用則對果酒的總體風味產生積極的影響。野生型果酒酵母經分離純化后，結合誘變、雜交、原生質體融合、基因工程及其他育種技術，其釀造性能顯著提高，釀造的果酒品質明顯改善，因此

2、果酒酵母的選育研究得到了重點關注。本實驗選用葡萄為原料，分離純化了3株酵母菌，并對其篩選使其適合果酒釀造。1、 實驗目的1、學習掌握果酒酵母分離純化的方法；2、對分離純化得到的酵母菌進行篩選使其適合果酒釀造。二、實驗原理 釀酒酵母細胞透明，呈圓形或橢圓形，形體比較大，一般為7×12m，含有轉化酶能將葡萄汁中的糖轉化成乙醇、二氧化碳和其它代謝產物。優良純種酵母應具備下列性能：1、除釀酒水果本身的果香外，酵母也應產生良好的果香與酒香。2、生長速度快，有較高的發酵能力，能將糖分全部發酵完。3、具有較高的抗S02能力，有較好的凝集力和較快的沉降速度。4、培養基成分簡單，來源廣泛，價格低廉，對

3、溫度，pH，離子強度，溶氧等環境因素不敏感。5、能在低溫或果酒適宜溫度下發酵，以保持果香和新鮮清爽的口味。由此可見，酵母的品質對果酒的產量和質量影響很大。要獲得優良的釀酒酵母，必須對其進行分離選育。果酒酵母的篩選應從相應的果品及其種植環境中采樣分離，如成熟果實的表皮、自然腐爛發酵的果肉或果汁和果園的土壤等相關場所。根據實踐經驗，在果汁和自然發酵的果酒醪液中檢出率較高，因為它們的基質環境與釀酒環境很相似。為使我們需要的酵母易于檢出，應對采集的樣品進行富集培養，通過設置較高的酒精濃度、添加SO2、調整pH 等手段抑制不需要的微生物的生長，使希望檢出的微生物得到增殖。酵母檢出后，應對其的發

4、酵性能進行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和風味物質形成的能力等，這些可通過作生理生化實驗和三角瓶小型發酵實驗分析和測定。3、 實驗儀器與材料富集培養基：乳酸馬鈴薯葡萄糖培養液：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，乳酸20g，蒸餾水1000ml（先將馬鈴薯去皮、切片，稱200g，并加蒸餾水1000ml，煮沸半小時，用紗布過濾，補足蒸餾水量至1000ml，制成20%的馬鈴薯汁，在20%的馬鈴薯汁中加入乳酸，煮沸融化，加入葡萄糖，補足水分并在121攝氏度條件下，高溫滅菌30分鐘）釀酒酵母培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，制法同上。器具：15個

5、培養皿、12支試管、4個100ml錐形瓶、3個250ml燒杯、30個試管、30個杜氏管、1個試管架、7個三角瓶，無菌滴管，接種環，酒精燈，玻璃涂棒，冰箱，高溫滅菌鍋，水浴鍋，顯微鏡，血球計數板，恒溫培養箱、恒溫搖床。4、 實驗內容及步驟1、 酵母的分離與純化1.1接種：取成熟的蘋果的小塊果皮直接接入250ml錐形瓶含有150ml的乳酸馬鈴薯葡萄糖培養液中，需要三組，置于28攝氏度恒溫搖床中，轉速為120，震蕩培養48h；將蘋果果皮研磨直接接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中，需要三組，置于29攝氏度恒溫培養箱中，培養48h；1.2培養：用無菌吸管吸取上述培養后培養液1ml，置于9ml的無菌水中，稀釋為

6、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；1.3分離、純化：馬鈴薯葡萄糖培養基溶化后制成平板，用1ml的無菌吸管，分別吸取10-3、10-4、10-5置于培養基表面，用無菌的玻璃涂棒迅速涂抹均勻，培養基做好標記，放于恒溫培養箱培養大約兩天，培養基倒置，菌落長出后，觀察其菌落并用顯微鏡查菌體數。一般一個單獨的菌落可視為一個細胞發育而來，是純培養，如果結構復雜未得到純培養，可進行再次分離培養知道純化為止，步驟如下：A. 將融化了的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基倒入無菌培養皿中，每皿大約15ml，冷凝成平面，記上標記；B.用平板劃線法接種（一）右手持接種環，經火焰滅菌，待涼后，挑取菌體培養物少許。（

7、二）左手斜持瓊脂平板，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的十分之一），劃線時接種環與平板表面成3040º角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環不應劃破培養基表面。（三）燒灼接種環，殺滅環上殘留細菌，待冷（是否冷卻，可先在培養基邊緣處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續平行劃線，約占平板表面五分之一左右，再次燒灼接種環，等三次平行劃線以同樣方法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。（四）劃線完畢，蓋上皿蓋，底面向上，用標簽注明菌名和組名，置恒溫箱中培養，長出菌落即可。2、 酵母的篩選與保藏2.1酵母菌種的復篩發酵力

8、實驗：取100ml三角瓶，各加入80ml果汁，置于80攝氏度的水浴殺菌5min，冷卻到30攝氏度后，按每升接種30ml的比例分別接入酵母種子液，在20攝氏度下發酵。發酵過程中每24小時測定1次三角瓶質量，確定菌株發酵力的強弱。2.2酵母菌的耐受性試驗1.用配好的PDA液體培養基，將培養基分別倒入試管與三角瓶中，試管每支10ml，共300ml，三角瓶每瓶50ml、共350ml。再將三角瓶和試管在121°高溫下滅菌30min。杜氏管倒置放入試管中，保證杜氏管中沒有氣泡。2.采用杜氏管發酵法測定所篩選的酵母菌對乙醇（4%、6%、8%、10%、12%）、二氧化硫（40、60、80、100、1

9、20mg/l）的耐性。按下表在試管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115 20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度為常溫后按下表加入酒精，加完后搖勻。最后在每個編號試管中接入對數期酵母1×107個，28靜止培養。觀察產氣情況，選出耐酒度比較好的菌種。將標簽貼于各試管上，標10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：試管編號010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15果汁/mL108.958.748.608.328.107.85培養液含酒精%（v/v）0101214161820按亞硫酸含量為6% 計， 計算出60

10、、100、120、180、240 mg/L濃度所需的量，分別加入到果汁中制成SO 2 不同濃度系列的液體培養基。按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充滿果汁，塞好棉塞，115 20min滅菌。滅菌完后，待試管溫度常溫后按上表加亞硫酸（科密歐試劑SO2含量6%），加完后搖勻。最后在每發酵管中接入對數期酵母1×107個，28靜止培養。觀察產氣情況，選出耐SO 2比較好的菌種。將標簽貼于各試管上，標1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：試管編號012345亞硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培養液含SO2mg/L060100120180240將酵母菌

11、分別接入含不同濃度的乙醇和不同濃度二氧化硫的果汁培養基中，在相同條件下培養，觀察杜氏管中氣泡產生情況。5、 實驗結果：發酵力實驗：菌種對照12345菌198.0g97.8g97.8g97.7g97.7g97.7g菌298.5g98.3g98.2g98.0g98.0g97.9g菌3103.3g103.2g103.1g103.0g103.0g102.9g耐受性實驗：菌株2：酒精量（%）4681012杜氏小管產氣情況+二氧化硫濃度（mg/L)406080100120杜氏小管產氣情況+菌3：酒精量（%）4681012杜氏小管產氣情況+二氧化硫濃度（mg/L)406080100120杜氏小管產氣情況+實

12、驗結果分析：發酵力實驗當中，菌種一的失重量為0.3g，菌種二的失重量為0.6g，菌種三的失重量為0.4g，因此，菌種二的發酵力較好。耐受性實驗當中，菌種一沒有氣泡產生，菌種二耐酒精及耐二氧化硫的程度比菌種三要穩定。菌種保藏：本實驗采用試管斜面保藏。 酵母菌的富集培養純化的酵母菌酵母菌顯微鏡下的酵母菌純化的酵母菌稀釋富集培養液果酒釀造：果酒釀造的工藝流程 鮮果分選破碎、除梗果漿分離取汁澄清清汁 發酵倒桶貯酒過濾冷處理調配過濾成品 發酵前的處理前處理包括水果的選別、破碎、壓榨、果汁的澄清，果汁的改良等。 碎、除梗： 破碎要求每粒種子破裂，但不能將種子和果梗破碎，否則種子內的油酯、糖苷類物質及果梗內

13、的一些物質會增加酒的苦味。破碎后的果漿立即將果漿與果梗分離，防止果梗中的青草味和苦澀物質溶出。二氧化硫處理： 二氧化硫在果酒中的作用有殺菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和單寧物質溶出、還原作用、使酒的風味變好等。使用二氧化硫有氣體二氧化硫及亞硫酸鹽，前者可用管道直接通入，后者則需溶于水后加入。發酵基質中二氧化硫濃度為60-100mg/L。（以葡萄酒為例：二氧化硫添加量的計算：葡萄果實×70%×60/0.06×1000。）此外，尚需考慮下述因素：原料含糖高時，二氧化硫結合機會增加，用量略增；原料含酸量高時，活性二氧化硫含量高，用量略減；溫度高，易被結合且易揮發，用量略

14、減；微生物含量和活性越高、越雜，用量越高；霉變嚴重，用量增加 。果汁的調整： 取汁測定果汁中糖度和酸度，根據發酵需要調整糖度和酸度。糖的調整： 釀造酒精含量為10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20°Bx。如果糖度達不到要求則需加糖，實際加工中常用蔗糖或濃縮汁。酸的調整： 酸可抑制細菌繁殖，使發酵順利進行；使酒顏色鮮明；使酒味清爽，并具有柔軟感；與醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的貯藏性和穩定性。干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%時應該對果汁加酸。3）酒精發酵發酵分主（前）發酵和后發酵，主發酵時，將果汁到入容器內，裝入量為容器容

15、積的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，攪拌均勻，溫度控制在20-28 ，發酵時間隨酵母的活性和發酵溫度而變化，一般約為3-12天。殘糖降為0.4%以下時主發酵結束。然后應進行后發酵，即將酒容器密閉并移至酒窯，在12-28 下放置 1個月左右。發酵結束后要進行澄清，澄清的方法和果汁相同。發酵性能測定測定一個發酵周期內酒精度及含糖量變化，繪制發酵曲線，并對自制果酒進行感官評定，分析測定理化指標（糖度、酒度、酸度）。還原糖、總糖的測定：直接滴定法。總酸的測定：中和滴定法。酒度的測定：蒸餾法。實驗結果：4月1日：菲林試劑比色法側總糖和還原糖。V3=5.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=219.225g4月2日：菲林試劑比色法側總糖和還原糖。V3=4.4mlX=Fx1/V1X1/V3X1000(F=0.05925) 得x=268.995g4月3日：菲林試劑比色法側總糖和還原糖。V3=5mlX=Fx1/