1、紫花苜蓿抗旱的研究進展趙穎（甘肅農業大學 甘肅蘭州 730070）摘要：干旱是影響植物生長發育及作物產量的逆境因素之一,影響了植物的正常生長發育，導致植被減少和草地退化等現象。有關苜蓿的抗旱性研究一直以來都是牧草學研究的熱點之一,研究領域也逐漸從形態水平發展到生理、生化及分子生物學等更深入的領域,并取得了很多有價值的研究成果。現對苜蓿在干旱脅迫下各項生理指標、分子水平及品種選育的研究進行綜述,并對研究中存在的問題及今后的應用前景進行了簡單的討論。1 形態指標與抗旱性1.1 葉片結構與抗旱機制水對于植物來說是必不可少，植物一旦缺水就會發生枯萎甚至死亡。當干旱發生時，植物的組織器官、個體形狀、大小

2、以及群體的組成形態都會產生相應的反應4。抗旱性與植物葉片表皮外壁的角質層、柵欄組織、海綿組織等有密切關系。一些植物的葉細胞小，細胞壁較厚，厚壁的機械組織發達，上表皮細胞大于下表皮細胞，葉片氣孔多而小，氣孔均位于下表皮且居于表皮細胞水平下面，葉脈較密，輸導組織發達，葉片表面絨毛多，角質化程度高或蠟質層厚，葉脈中的含晶細胞，這些葉片形態有利于增強植物對水分的吸收和運輸并且減少了水分的蒸發和丟失，因此有較強的抗旱性5胡營等對不同水分處理的四個花苜蓿居群葉片解剖結構進行研究表明：不同水分處理對柵欄組織厚度具有明顯的影響。相比濕潤條件處理,在干旱條件下柵欄組織厚度都有明顯增加, 細胞排列緊密程度也有所變

3、化, 干旱條件下, 花苜蓿第一層柵欄組織細胞密集度較濕潤條件下明顯增大。隨著水分的減少,海綿組織厚度也會減少,但陜西省興隆山居群花苜蓿卻呈現相反態勢,在干旱處理下,海綿組織相對較厚。1王赫等研究發現，隨著干旱處理時間的繼續,苜蓿幼苗出現不同程度的萎蔫,以野生黃花苜蓿和Gongnong紫花苜蓿最嚴重,出現了小葉合攏卷曲,頂端葉片枯黃脫落等現象。幼苗株高、根長、分枝、根頸直徑、葉面積都不同程度的呈減小趨勢。6 逆境條件下植物葉片相對含水量可反映植物的保水能力,是標志植物水分狀況的重要指標。南麗麗7等研究發現，各根系類型苜蓿葉片相對含水量隨干旱脅迫程度的增加呈降低趨勢。張攀8等研究表明，干旱脅迫下根

4、瘤菌共生紫花苜蓿葉片相對含水量在干旱前期顯著高于不接種根瘤菌紫花苜蓿。1.2 根系與抗旱機制 根系相對含水率是反映植物根系水分狀況的重要指標之一RWC能真實反映土壤缺水時植物根系水分的虧缺程度。許多研究表明,干旱脅迫抑制植物株高和根長的伸長,降低干物質的積累,改變干物質分配比例14 18。根頸是產生枝條的重要部位,直接影響苜蓿生產性能及其抗逆性,脅迫下根頸直徑顯著的變小。植物器官中葉片對干旱脅迫最敏感,葉面積的減小對植物來說是十分不利的20,因為營養物質的吸收、蒸騰作用和碳同化作用都與葉面積呈顯著的正相關21。葉綠素是綠色植物進行光合作用的主要色素,其含量的多少與牧草的光合作用及其強度有密切的

5、關系。苜蓿葉綠素含量都隨干旱脅迫的加重而降低。2紫花苜蓿抗旱的生理生化特性研究進展2.1 光合作用與抗旱性光合作用是植物干物質產生積累的重要方式，與植物的生長密切相關。干旱脅迫容易導致光能過剩從而危害植物體內光合器官。光保護的主要途徑是通過葉黃素循環的熱耗散，并且酶促及非酶促系統也是保護光合器官免受破壞的重要過程1王赫等研究發現，干旱脅迫下植物光合作用受到極大的影響,表現為凈光合、蒸騰速率下降,氣孔導度減小,水分有效利用率降低等現象。隨著干旱脅迫強度的增加,各項指標急劇下降,光合同化作用受影響較大。6 干旱脅迫引起光合作用降低,是由于氣孔關閉阻礙了CO2的交換和對CO2同化的非氣孔性機制26。

6、有研究指出,抗旱性好的苜蓿葉片的下表皮上具有較多的氣孔,有較強的氣體交換能力27,蒸騰失水量較低28,29。王赫等對4種苜蓿幼苗研究發現，Daviluya、和Culuskaya在干旱脅迫時,能保持相對較大的氣孔導度,維持一定強度的蒸騰作用,使植物能在自身水勢較低的情況下吸收水分,水分有效利用率較高,更好地維持植物正常的新陳代謝。6 相對較高的葉片相對含水量可以有效地保持葉綠體的結構和PS功能,使植物進行有效的光合作用。能維持較高相對含水量的植物,其抗旱能力亦較強。2.2 干旱對苜蓿種子萌發的影響聚乙二醇 PEG-6000 因本身不易自由通過植物細胞壁，不易滲入活細胞內，不會給種子內增加營養物質

7、，且無毒，但能減緩萌發初期水分進出種子的速率等優點，常被作為干旱脅迫的滲透脅迫劑。榮秀連等3研究認為，不同 PEG-6000 脅迫處理下 3 種冷季型草坪草種子的發芽率、發芽勢以及胚根的生長受到抑制，抑制程度隨濃度的增加越發明顯。伏兵哲等2研究發現，苜蓿種子的相對發芽率和相對發芽勢較對照有明顯的下降，并隨脅迫水勢的加劇，相對發芽率和相對發芽勢呈下降趨勢，沒有發現低濃度 PEG-6000 對苜蓿種子萌發有促進作用。2.3 滲透調節物質與苜蓿的抗旱性2.3.1 脯氨酸含量與苜蓿抗旱性Pro是植物體內重要的滲透調節物質之一當植物受到逆境脅迫時，尤其是干旱時造成體內脯氨酶積累最多一般而言，抗旱性強的植

8、物Pro積累時間長，積累量也較大。朱新強10等對4個苜蓿品種幼苗進行研究發現，干旱脅迫均促進了4個苜蓿品種根系Pro的增加，不同程度干旱脅迫處理下，4個苜蓿品種根系Pro含量差異顯著。王赫等研究發現，葉片游離脯氨酸含量均隨干旱脅迫強度的加劇而增加，幼苗在干旱脅迫下電解質外滲率升高。6 電解質外滲率反映脅迫下膜系統受損情況,抗旱性強的苜蓿品種干旱脅迫后細胞外滲液的電導率較低11 滲透調節是植物對干旱逆境的一種重要生理適應機制,作為主要滲透調節物的脯氨酸在干旱條件下大量積累有助于植物細胞或組織的持水,增強其抗旱性。有研究表明：干旱脅迫下各根型苜蓿葉片脯氨酸含量均顯著高于對照。重度脅迫下，各根系類型

9、苜蓿脯氨酸積累量達到最大7。2.3.2 MDA含量與苜蓿抗旱性植物器官在逆境下遭受傷害，往往發生膜脂過氧化作用，是膜脂過氧化的最終分解產物，可以衡量逆境下膜脂過氧化水平，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，即膜脂過氧化程度隨品種抗旱性下降而加劇。隨著干旱脅迫程度的加劇，個苜蓿品種根系 含量都逐漸增多，但MDA的積累程度在不同品種間表現不同10。有研究發現，不接種根瘤菌紫花苜蓿根、蓮、葉中含置明顯髙于根瘤菌共生紫花苜蓿，各脅迫時間點均差異顯著8。2.3.3 干旱脅迫下紫花苜蓿中游離態多胺含量的變化植物感受干旱脅迫時，多胺水平升高，含量的積累與植物抗旱性關系密切劉義30等研究表明，干旱脅迫下，紫

10、花苜蓿幼苗葉片中種游離態多胺（Put、Spd、Spm）的含量均大幅度增加，隨著脅迫時間的延長先上升后下降，且脅迫程度越大，多胺的增加幅度越大。PA 可通過穩定質膜和提高細胞內保護酶（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶）活性以及提高ABA含量或改變不同激素成分的含量來增強對滲透脅迫的抵抗能力。逆境脅迫下，活性氧的產生與清除體系與多胺存在著重要的關聯。干旱脅迫下，紫花苜蓿體內多胺代謝的變化是對干旱逆境的一種抵御和適應機制。2.3.4 可溶性糖與苜蓿抗旱性TSS是植物體內另一種重要的滲透調節物質，被認為是對干旱忍耐的適應物質，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等TSS是一種較為

11、有效的滲透保護劑，它可有效地提高細胞的滲透濃度,降低水勢,增加保水能力,對原生質體起到保護作用。在干旱逆境脅迫下，隨脅迫程度的加劇，TSS含量增加朱新強等研究發現，不同苜蓿品種根系TSS含量隨干旱脅迫程度的加劇而升高，不同程度干旱脅迫下，各苜蓿品種根系TSS含量差異顯著。2.3.5 脫落酸與苜蓿抗旱性2.4 其他酶類與抗旱機制 PAO是催化生物體內降解的關鍵酶之一，Put和Spd的過度積累將作為一種很好的底物激發PAO活性，PAO通過調節細胞內PAs的水平和生成物濃度參與植物體對逆境脅迫的反應和生長發育過程。 干旱脅迫下，紫花苜蓿中PAO活性與Spd、Spm含量變化趨勢相似且呈極顯著相關，可能

12、是Spd、Spm二者含量的增加反饋致其氧化酶PAO活性增高，進而維持多胺代謝平衡19劉義30等研究認為， 精氨酸脫羧酶（ADC）和鳥氨酸脫羧酶（ODC）為多胺生物合成的關鍵酶。干旱脅迫下紫花苜蓿葉片和根系中 ADC、ODC活性變化趨勢相似。隨脅迫程度增大，二者活性均增大，隨著脅迫時間的延長，二者活性先增大后減小。植物體內多胺氧化酶（PAO）催化亞精胺和精胺分解產生的 H2O2，會對植物細胞造成一定的傷害。干旱脅迫下，紫花苜蓿葉片和根系中PAO活性上升，處理期間PAO活性上升幅度隨脅迫程度加重而增大，隨脅迫時間的延長，各處理PAO活性呈先增大后減小的趨勢，這與Spd、Spm 含量變化相似。 SO

13、D是細胞膜系統的重要保護酶之一，它具有消除自由基、降低膜脂過氧化及維持細胞膜穩定性的功能。朱新強等研究表明，各苜蓿品種根系SOD活性隨干旱脅迫程度的加劇呈上升趨勢，不同品種苜蓿根系 SOD 活性在不同程度干旱脅迫下差異顯著。張攀8等研究表明，根瘤菌共生紫花苜蓿根、莖、葉中可溶性糖含量、含量、含量及和活性在干旱后期明顯高于不接種根瘤菌紫花苜蓿。根瘤菌共生紫花苜蓿具有更強的滲透調節能力和活性氧防御能力。2 紫花苜蓿抗旱分子機制研究進展 2.1 紫花苜蓿抗旱基因工程研究 水資源不足是影響紫花苜蓿分布及產量的重要因素之一改良苜蓿抗旱性的基因工程研究也越來越受到重視。Rubio等42將Mn-SOD和Fe

14、-SOD同時轉入紫花苜蓿，發現在水分脅迫后，轉基因植物的光合活性平均提高了20%。Zhang等43將從截形苜蓿中克隆的轉錄因子AP2的Cdna(WXP1)轉入紫花苜蓿，轉基因苜蓿葉片表皮臘層厚度增加，有效的減少了水分損失，提高了植株抗旱性。Jiang等44采用CER6啟動子在紫花苜蓿中超表達WXP1基因，結果同Zhang等43的研究一致，轉基因植株抗旱能力提高。劉媛等45研究發現，轉BADH基因的紫花苜蓿對聚乙二醇造成的滲透脅迫具有較強的抗性。Tang等46研究發現，超標達野生大豆鋅指蛋白基因GsZFP1的紫花苜蓿耐鹽、抗旱能力明顯提高，其逆境響應基因MtCOR47,MtRAB18,MtP5C

15、S和MtRD2的表達量高于野生型苜蓿。Suarez等47將酵母海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因TPS1和海藻糖-6-磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因TPS2融合，轉入紫花苜蓿，發現轉基因植物具有較好的抗旱、抗寒能力，這是首次將海藻糖代謝基因應用于紫花苜蓿基因工程中。Bao48等將擬南芥的液泡焦磷酸化酶基因（H+-PPase）AVP1轉入紫花苜蓿中，研究發現與野生型相比，轉基因苜蓿在脅迫下的光合能力增高，對干旱的抗性明顯增加。總之紫花苜蓿抗旱性相關基因的發現和轉化研究豐富了紫

16、花苜蓿抗旱基因工程，為改良苜蓿抗旱性奠定了研究基礎。2.2 苜蓿中發現的與干旱脅迫有關基因湛虎50用mRNA差異顯示技術分析干旱脅迫下苜蓿基因表達與正常供給水分的苜蓿基因表達的差異片斷。通過RNA的提取和mRNA差異顯示技術篩選-共得到苜蓿的差異表達片斷32條。通過DDRT-PCR技術和Reverse Northern技術結合,篩選得到3條苜蓿受干旱脅迫后差異表達的基因片斷。其中,1個與基因庫中擬南芥水通道蛋白(Water channel)控制基因同源性達到99%,為干旱誘導表達的重要基因。另外2個基因片斷與其它基因的同源性都比較低,可能為干旱誘導表達的新基因。羅琰53從紫花苜蓿中分離得到1個

17、RNA解旋酶基因,命名為MH1。研究結果表明,MH1基因在植物耐受非生物脅迫的過程中起重要作用,它通過提高某些逆境響應基因的表達提高植物的活性氧清除能力和滲透調節能力,從而使得表達MH1的轉基因擬南芥不同株系耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫能力都有顯著提高,說明紫花苜蓿中受脅迫誘導表達的解旋酶基因MH1參與了植物的耐旱、耐鹽和抗氧化脅迫過程。2009年又將該基因轉入到擬南芥中,再次確信了該基因表達能夠提高植物抗旱,抗鹽害的能力,因為它對ROS起反應。Tapia G等55通過系統發育分析發現,苜蓿的第3類內切幾丁質酶中有1個命名為Ltchi7的基因簇,它編碼1個334氨基酸構成的肽段,在干旱脅迫下,該基因

18、轉錄的豐度增強。王天佐54等通過GO分類和KEGG分析等手段對文庫中序列進行分類，并分析表達序列的差異，發現黃花苜蓿文庫中對抵抗水分脅迫起積極作用的基因表達序列明顯多于蒺藜苜蓿。此外，還對篩選到的個基因在種苜蓿中的干旱響應表達模式進行了分析，結果表明，在黃花苜蓿中這個基因的表達更加有利于響應和抵抗干旱。2.3 耐旱相關分子標記技術通過分子標記的方法標記某種抗性基因,是近年來育種的新技術。康俊梅等56采用RAPD技術共篩選得到48個引物對不同抗旱性苜蓿品種池DNA擴增結果產生多態性,其中5個引物能夠穩定標記DNA多態性,且特異性明顯,表明不同抗旱性苜蓿品種之間具有明顯的遺傳多樣性。Sledge

19、M K等57通過SSR標記(主要是將來源于表達序列標簽(ESTs)和細菌人工染色體(BAC)的插入蒺藜苜蓿)構建1個四倍體苜蓿的分子標記圖譜,該圖譜可用于苜蓿耐旱QTL的鑒定。3 紫花苜蓿生產與抗旱品種的選育研究進展盡管不同研究者對抗旱性研究從多方面做了大量的研究工作,并進行了有益的探討,但是由于作物抗旱性不僅與作物的種類、品種基因型、形態性狀及生理生化反應等有關,而且受干旱發生的時期、強度及持續時間的影響,所以作物抗旱性是復雜的數量性狀24。山侖認為,不同作物和品種適應干旱的方式是多種多樣的,一些作物和品種具有綜合的幾種機制共同起作用的抗旱性25。我國對苜蓿抗旱育種的研究幾乎是空白。目前主要

20、從生理生態指標加以分析,中國科學院蘭州沙漠研究所陶玲對甘肅省紫花苜蓿進行抗旱等級分類,對21個抗旱性指標實驗測定,根據這些指標應用系統聚類的方法進行分級聚類,使其歸屬5個抗旱等級5。甘肅農業大學草原系馬宗仁、陳寶書對甘肅境內不同地理分布的9個苜蓿品種抗旱性進行研究,結果表明苜蓿的抗旱性與其地理分布密切相關,由此可見不同地理分布的苜蓿之間具有遺傳差異性6。中國農科院生物技術研究所夏蘭芹等人對分子標記技術在苜蓿育種中應用作了分析總結。他們總結了2種主要的分子標記技術在苜蓿育種中的3個方面的應用,即分子標記輔助育種和種質漸滲研究、遺傳連鎖圖譜繪制、種質鑒定和遺傳多樣性7。這些技術的不斷發展和完善對今

21、后苜蓿的抗旱育種提供有效的途徑。參考文獻：1 胡營，楚海家，李建強，等 . 4個花苜蓿居群葉片解剖結構特征及其可塑性對不同水分處理的響應 J . 植物科學學報，2011,29(2):218 2252 伏兵哲，蘭劍，李小偉，等 . PEG6000干旱脅迫對16個苜蓿品種種子萌發的影響 J . 種子，2012（4）：1014 .3 榮秀連，王波，劉刊，等 PEG-6000 模擬干旱脅迫對冷季型草坪種子萌發特性影響J 北方園藝，2010( 8) :80 824 楊帆，苗靈鳳，胥曉，等 植物對干旱脅迫響應的研究進展J 應用與環境生物學報，2007，13(4) : 586 5915 李磊，賈志清，朱雅娟

22、，等 我國干旱區植物抗旱機理研究進展J 中國沙漠，2010，9(5) :1053 10596 王赫，劉利，周道瑋，等. 4種苜蓿屬植物幼苗的抗旱性研究 J草地學報，2010，18(2):205 211 .7 南麗麗，師尚禮，朱新強，等 . 不同根型苜蓿苗期對干旱脅迫的生理耐受性分析 J . 2011, 29(5):1061108 張攀，楊培志，王衛東，等 . 干旱脅迫下根瘤菌共生紫花苜蓿抗旱生理變化研究 J . 草地學報，2013,21(5):938944910 朱新強，張新穎，時尚禮，等. 干旱脅迫下4個苜蓿品種根系抗旱性的比較 J .甘肅農業大學學報，2012，41(1):103107 1

23、1 李明,王根軒.干旱脅迫對干草幼苗保護酶活性及脂質過氧化作用的影響J.生態學報,2002,22(4):503-507121314 Liu F, Sttzel H. Biomass partitioning, specific leaf area, andwater use efficiency of vegetable amaranth(Amaranthus spp.)in response to drought stress J. Scientia Horticulturae,2004, 102: 15-2715 徐炳成,山侖.苜蓿和沙打旺苗期需水及其根冠比J.草地學報,2003,11(1

24、):78-8216 Liu H Sh. Deficiency of water can enhance root respirationrate of drought-sensitive but not drought-tolerant spring wheatJ. Agriculture Water Management, 2004, 64: 41-4817 Lucero D W. Effects of deficit and plant interaction on mor-phological growth parameters and yield of white clover and

25、ryegrassJ. European Journal of Agronomy, 1999, 11: 167-17718 Kage H, Kochler M. Root growth and dry matter partitioningof cauliflower under drought stress conditions: measurementand simulation J. European Journal of Agronomy, 2004,20: 379-39419 Jia W S , Zhang J H . Stomata movements and long-distan

26、ce signaling in plants J .Plant Signaling and Behavior , 2008, (10):772-77720 OToole J C, De Datta S K. Drought resistance in rainfed low-land riceM. In: Progress in Rainfed Lowland Rice, Interna-tional Rice Research Institute, Makati City, Philippines. 1986, 145-15821 Schulze E D. Whole-plant respo

27、nses to droughtJ. AustraliaJournal of Plant Physiology, 1986, 13: 127-141222324 景蕊蓮.作物抗旱研究的現狀與思考J.干旱地區農業研究,1999,17(2):79 85.25 山侖.作物抗旱生理生態與旱地農業.北京:科學出版社,1998:1 17.26 韓瑞宏,盧欣石.苗期紫花苜蓿對干旱脅迫的適應機制J.草地學報,2006,14(4):393-39427 韓德梁,王彥榮.紫花苜蓿對干旱脅迫適應性的研究進展 J.草業學報,2005,14(6):7-1328 程偉燕,張衛國,哈斯其木格.特萊克紫花苜蓿的形態解剖學觀察J.

28、內蒙古民族大學學報,2003,6:251-25429303132333435363738392 關軍鋒，劉海龍，李廣敏干旱脅迫下小麥幼苗根、葉多胺含量和多胺氧化酶活性的變化植物生態學報，（）：3 牛明功，陳龍，王賢，等干旱脅迫對小麥幼苗葉片多胺含量的影響熱帶亞熱帶植物學報，（）：4 汪耀富，張瑞霞滲透脅迫下烤煙內源多胺含量及其代謝酶活性變化干旱地區農業研究，（）：5 宋鳳斌，戴俊英干旱脅迫下玉米葉片乙烯釋放和多胺含量的變化及其與玉米耐旱性的關系東北農業大學學報，（）：6 胡炳義，牛明功，王啟明，等滲透脅迫與大豆幼苗葉片多胺含量的關系植物營養與肥料學報，（）：42 Rubio M C, Gonz

29、ález E M, Minchin F R, et al. Effects of water stress on antioxidant enzyme of leaves and nodules of transgenie alfalfa overexpressing superoxide dismutases J. Physiologia Plantarum,2002,115(4):531-54043 Zhang J Y, Broeckling C D, Blancaflor E B, et al. Overexpression of WXP1, a putative Medica

30、go truncatula AP2 domain一containing transcription factor gene, increases cuticular wax accumulation and enhances drought tolerance in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.)J. The Plant Journa1,2005,42(5):689-70744 Jiang Q ,Zhang J Y, Guo X. Physiological characterization of transgenic alfalfa ( Med

31、icago sativa) plants for improved drought tolerance J. International Journal of Plant Science,2009,107(8):969-97845劉媛，X陽，楊克強，等.滲透脅迫下轉BADH基因首箱組培苗的抗性響應J.中國農學通報，2009,25(4):133-13646 Tang L L, Cai H, Ji W et al. Overexpression of GsZFPl enhances salt and drought tolerance in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) J. Plant Physiology and Biochemistry,2013,71:22-3047 Suárez R, Calderán C, Iturriaga G. Enhanced tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic alfalfa accumulating trehalose 1. Crop Science,2009,49(5):1791-179948 Bao A K, Wang S M, Wu G Q ,et al. Overe