1、4. inspection 觀察觀察5. identification 鑒定鑒定2. incubation 培養培養3. isolation 分離分離five is1. inoculation 接種接種一、實驗目的一、實驗目的學習檢測微生物代謝特性的試驗方法掌握 淀粉水解試驗 糖發酵試驗 吲哚試驗 vp試驗 石蕊牛乳試驗 的反應原理及操作二、實驗原理二、實驗原理同種的細菌具有相同或相近的表型特征（形態、同種的細菌具有相同或相近的表型特征（形態、生理特征、代謝產物等），而細菌的生理特征，主生理特征、代謝產物等），而細菌的生理特征，主要取決于酶的催化作用，但各種細菌具有不同的酶要取決于酶的催化作用

2、，但各種細菌具有不同的酶系統，從而導致系統，從而導致代謝類型的多樣性代謝類型的多樣性。 在所有生活細胞中存在的這些化學反應被稱為在所有生活細胞中存在的這些化學反應被稱為生理生化反應（酶促反應生理生化反應（酶促反應 ）。）。 人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生理生化反應作為重要的分類依據。理生化反應作為重要的分類依據。三、實驗材料三、實驗材料1. 實驗菌種：實驗菌種：枯草桿菌（枯草桿菌（bs）、大腸桿菌）、大腸桿菌（ec）2培養基：（培養基：（2人為一組）人為一組） 淀粉培養基（固體）：淀粉培養基（固體）：1皿皿/人人 糖發酵管糖發酵管(乳糖、葡萄糖

3、、蔗糖各乳糖、葡萄糖、蔗糖各2只）：只）：6支支/組組 蛋白胨水培養基：蛋白胨水培養基：4支支/組組 葡萄糖蛋白胨水培養基：葡萄糖蛋白胨水培養基：4 4支支/組組 石蕊牛乳培養基：石蕊牛乳培養基：2支支/組組3實驗開始前分別標記好每一組試管，一半為實驗開始前分別標記好每一組試管，一半為bs，一半為一半為ec。四、實驗內容四、實驗內容1. 淀粉水解試驗（原理：淀粉遇碘變藍）淀粉水解試驗（原理：淀粉遇碘變藍）細菌對大分子的淀粉不能直接利用，須靠產生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細菌吸收利用，細菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產生

4、藍色。（1）倒平板，凝固后在培養皿底面兩側的中央位置分別標記bs或ec。（2）用接種環以點接的方式接上菌種。一邊接枯草桿菌bs，另一邊接大腸桿菌ec。（3）將接完種的平板倒置于37恒溫培養箱，培養7。（4）觀察結果時，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。 透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強弱，即產生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有無透明圈）具體操作：具體操作：2. 糖類發酵試驗（含碳化合物的分解利用）糖類發酵試驗（含碳化合物的分解利用）原理及現象：原理及現象：不同糖類經不同代不同糖類經不同代謝

5、途徑分解后可產謝途徑分解后可產生有機酸，氣體或生有機酸，氣體或二者都有，借助于二者都有，借助于。ph5.2, 溶液由清亮紫色變為渾濁黃色溶液由清亮紫色變為渾濁黃色 乳酸、醋酸、丙酸乳酸、醋酸、丙酸葡萄糖葡萄糖/乳糖乳糖甲烷、氫、二氧化碳甲烷、氫、二氧化碳杜氏小管內有氣泡，產氣漂浮杜氏小管內有氣泡，產氣漂浮（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌bs或大腸桿菌ec于葡萄糖、蔗糖、乳糖商品化發酵管中。以未接種的作為對照（全班1-2支試管即可）。（2）接種后置于37恒溫培養箱，培養7d。（3）觀察結果時，看各管顏色變化及小管頂部有無氣泡。產酸產氣用產酸產氣用“ ”表示；只產酸不表示；只產酸不產氣用產氣

6、用“+” 表示；不產酸也不產氣用表示；不產酸也不產氣用“-”表表示。示。具體操作：具體操作： - +3. 吲哚吲哚試驗：（試驗：（含氮化合物的含氮化合物的分解利用分解利用）（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于蛋白胨水培養基中。（2）接種后置于37恒溫培養箱，培養7d。以未接種的作為對照（全班1-2支試管即可）。（3）觀察結果時，在培養液中加入乙醚約1毫升（使呈明顯的乙醚層）。充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，待乙醚浮于培養液上面時，沿管壁慢慢加入吲哚試劑10滴。如吲哚存在，則乙醚層呈玫瑰紅色。 （注意：注意：加入吲哚試劑后，不可再搖動，否則紅色不明顯）。以“+”、“”表示有無

7、紅色的玫瑰吲哚。具體操作：具體操作： 某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養葡萄糖蛋白胨水培養基基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱vp（+）反應）反應。 2ch3cocooh ch3cochohch3十2co2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇ch3cochohch3 ch3cococh3乙酰甲基甲醇 naoh 丁二酮（二乙酰）v取出塞子，取出塞子， 加加10滴滴vp試劑，振蕩混合后，試劑，振蕩混合后，置沸水浴中保溫，置沸水浴中保溫，5分鐘后觀察實驗結果。分鐘后觀察實驗結果。出現紅色這位出現紅色這位vp試驗陽

8、性。試驗陽性。v接種及培養方式如同吲哚實驗接種及培養方式如同吲哚實驗具體操作：具體操作：5 . 石蕊牛乳試驗：（利用蛋白質酪素的能力）石蕊牛乳試驗：（利用蛋白質酪素的能力）牛乳的主要成分為乳糖，蔗糖，蛋白質和酪素等成分。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原的指示劑（中性為黃色中性為黃色，酸性為紅色酸性為紅色，堿性為藍色，石蕊被還原時，則部分或全部脫色）。由于各種細菌對牛乳的利用不同，引起培養基的變化也就不同，主要變化為：酸凝：酸凝：主要從乳糖產生酸，指示劑變紅色。 ph4.7以下時，有牛乳的凝固；如有氣體形成，則凝塊中有裂隙。凝乳酶凝固作用：凝乳酶凝固作用：很少或無酸產生，分泌凝乳酶使牛乳凝固。細菌產生蛋白酶可將干酪素分解產生胺或氨，使培養基的ph進一步升高，呈深藍紫色。胨化：胨化：酪蛋白被水解，部分或大部分牛奶變清亮。可在酸性或堿性條件下進行，石蕊被還原脫色。（1）以液體接種的方式分別接種枯草桿菌和大腸桿菌于石蕊牛乳培養基中。（2）接種后置于37恒溫培養箱，培養7-14d。（3）觀察結果時，看各管顏色變化及牛乳胨化的現象。具體操作：具體操作：五、實驗報告五、實驗報告1細菌對各種生理生化試驗反應的結果：細菌對各種生理生化試驗反應的結果：淀粉水淀粉水解試驗解試驗糖發酵試驗糖發酵試驗吲哚吲哚試驗試驗vp試驗試驗石蕊石蕊牛乳牛乳試驗試驗乳糖乳糖葡萄糖葡萄糖蔗糖蔗糖枯草枯草桿菌桿菌大