1、多色流式檢測的抗體組合設計多色流式檢測的抗體組合設計流式細胞儀的基本結構流式細胞儀的基本結構u流路：流路： 流動室流動室 鞘液鞘液 sheath 樣本流樣本流 sample u光路：光路： 光源光源 光學收集系統光學收集系統u電路電路： 光電倍增管光電倍增管(pmt)、光電、光電二極管、二極管、 放大器（線性、放大器（線性、對數）對數） a/d 轉換（光信號轉換為轉換（光信號轉換為電信號之后的處理分析電信號之后的處理分析 道道數和電信號的脈沖轉換數和電信號的脈沖轉換 ）u統計：計算機統計：計算機u細胞分選系統細胞分選系統 （分選器：噴嘴，穩定液（分選器：噴嘴，穩定液流，充電電路）流，充電電路）

2、488 nm laser+-charged platessingle cells sortedinto test tubesfcs sensorfluorescence detectorflow celllaser流流 路路流動室流動室側向及熒光信號側向及熒光信號前向散射光信號前向散射光信號鞘液鞘液激光激光 樣品管、鞘液管和流動室等樣品管、鞘液管和流動室等由于鞘液的作用，待測細胞被限制在液流的軸線上流體動力學聚焦流式細胞儀的光源和光路流式細胞儀的光源和光路光光 源源 采用激光光源采用激光光源 是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光照光斑直徑d可由下式確定：d=4f/d。為激光

3、波長；f為透鏡焦距；d為激光束直徑。激光源垂直透鏡（約束激光的寬度）橫向透鏡（約束激光的高度）形成小的橢圓形激光束流動室激光光路激光光路檢測信號檢測信號散射光測量原理散射光測量原理u波長與入射光一致，為細胞固有的物理及生理特性，可依此對未染色的細胞進行分析 散射光的性質散射光的性質 fs(forward scatter)fs(forward scatter)信號信號固有信號：細胞相對大小ssss(side scatter)(side scatter)信號信號固有信號：細胞相對復雜內部結構，粒度scfs外周全血細胞散射光雙參數點圖外周全血細胞散射光雙參數點圖 （紅細胞溶解后）（紅細胞溶解后）散射

4、光的性質散射光的性質 熒光信號檢測原理熒光信號檢測原理520nmfsc sensorlaserfluorescence sensor pmt(fl)u每種熒光染料均有特定的激發波長每種熒光染料均有特定的激發波長, , 并激發后會有發射波長并激發后會有發射波長, ,流流式細胞儀檢測的即是它特定的發射波長式細胞儀檢測的即是它特定的發射波長. . u利用各種不同波長的光學濾片來收集利用各種不同波長的光學濾片來收集( (檢測檢測) )這些光學信號這些光學信號 excited electronenergyemits energyas lightatom熒光素及熒光發生機理簡介熒光素及熒光發生機理簡介fi

5、tc熒光素的激發和發射光譜熒光素的激發和發射光譜熒光素的使用：熒光素的使用： 選擇正確的激光器；確定正確的濾光片；選擇正確的激光器；確定正確的濾光片； 確定所需熒光探測器確定所需熒光探測器（pmtpmt）ex 488nm em 520nm異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（fitc）520nm流式常用熒光染料流式常用熒光染料 violet blue greenyellow orange red infra-fitc520pe575ecd 615pc5665laser 488pi620400-450 l450-500 l500-570 l 570-590 l750 lpc7770epics xlfc

6、500（488nm）熒光信號熒光信號雙色直接染色雙色直接染色cd3-fitccd19-pe不同的熒光素標記不同的細胞抗原。不同的熒光素標記不同的細胞抗原。不同的熒光素在受到激發光激發后發射出不同波長的熒光。不同的熒光素在受到激發光激發后發射出不同波長的熒光。根據熒光波長可區分出不同細胞抗原。根據熒光波長可區分出不同細胞抗原。根據熒光信號的強弱可反映細胞抗原的表達含量。根據熒光信號的強弱可反映細胞抗原的表達含量。fitcfitcpe-cy5pe-cy5pepe熒光信號熒光信號long (700nm)(550lp)(550sp)short (500nm)dichroic filterstransm

7、itted 550 nmdiflected 90 550 nm550 nmlong (700nm)(500lp)(500sp)short (500nm)pass through filters(500/50)transmitted 500 nm475 - 525 nm wavelengths blocked500 nm500 nm525 nmshort passlong passband pass光學系統：濾光片（光學系統：濾光片（filter）熒光激發波長根據所選的熒光素而異，可通過一組不同的光學濾片傳遞熒光激發波長根據所選的熒光素而異，可通過一組不同的光學濾片傳遞到各個到各個pmt(pmt

8、(光電倍增管中光電倍增管中) )xl流式細胞儀光路圖air-cooled argon ion laserbeam shaping lenseshigh sensitivityquartz flow cellforward scatterdetectorside scatterdetector525bp fl1 (fitc)575bp fl2 (pe)620bp fl3 (ecd)675bp fl4 (pc5)488dl488bk550dl600dl645dlfc500流式細胞儀光路圖流式細胞儀光路圖488 dl488 bk550 dl525 bp600 dl575 bp640 dl620 bp

9、675 bp流式細胞儀的電路流式細胞儀的電路u進行信號檢測和分析進行信號檢測和分析u熒光信號由光電接收器（熒光信號由光電接收器（pmt）接收，轉變為電信）接收，轉變為電信號，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度號，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度u電脈沖信號經電脈沖信號經a/d轉換成數字信號轉換成數字信號u數字信號傳送到計算機，進行儲存、數字信號傳送到計算機，進行儲存、 作圖、作圖、 統計分統計分析析電脈沖信號的產生及光電管和檢測系統電脈沖信號的產生及光電管和檢測系統光電管和檢測系統：放大器光電管和檢測系統：放大器u基本原則 - 信號強弱差10倍or需分析弱熒光:使用對數放大器(如熒光)檢測的一般

10、步驟檢測的一般步驟1.1.設置檢測方案（設置檢測方案（protocol)protocol)2.2.染色標本（同型對照，補償管，待測樣本）染色標本（同型對照，補償管，待測樣本）3.3.同型對照管調電壓同型對照管調電壓4.4.電壓不變電壓不變，補償管調補償，補償管調補償5.5.電壓不變，補償不變，電壓不變，補償不變，上檢測管檢測后直接閱讀上檢測管檢測后直接閱讀結果結果電壓調節利用同型對照：設置背景電壓調節利用同型對照：設置背景u 電壓 voltsu 增益 gain設定陰性和陽性信號強度的設定陰性和陽性信號強度的臨界點臨界點熒光補償熒光補償fitcpe受激光照射后受激光照射后fitc和和pe分子發射

11、光譜相互干擾分子發射光譜相互干擾熒光補償的調節熒光補償的調節fl2 - %fl1fl-1(fitc)fl-2(pe)fl1 - %fl2補償調節利用單標樣本，來消除熒光交叉原則：單管單色標記交叉調節確認電壓單標記管自動計算crossover驗證管補償調節補償調節- -最精確的全矩陣軟件最精確的全矩陣軟件 利用軟件進行全矩陣顏色補償（任何兩個熒光檢利用軟件進行全矩陣顏色補償（任何兩個熒光檢測通道之間都可以進行補償）測通道之間都可以進行補償）數據分析數據分析dot plot（雙參數點圖）histogram（單參數直方圖） region（門） statistics（統計結果）參數影響一個成功的多色實

12、驗的因素：影響一個成功的多色實驗的因素：高靈敏，高分辨率的儀器高靈敏，高分辨率的儀器數據分析數據分析準確可信準確可信（kaluza）多色抗體組合方案設計多色抗體組合方案設計高質量的熒光抗體高質量的熒光抗體405nm405nm638nm638nm488nm488nmgallios/ navios gallios/ navios 流式細胞儀流式細胞儀gallios濾光片組合濾光片組合 多種抗原間的關系多種抗原間的關系影響檢測靈敏度的因素影響檢測靈敏度的因素檢測限制檢測限制抗原在細胞上的抗原在細胞上的分布情況分布情況krome orangekrome orangepacific orangepaci

13、fic orange染料熒光強度染料熒光強度熒光光譜熒光光譜空間位阻空間位阻非特異結合非特異結合制備滴定制備滴定 fitcfitcpepeecdecdpc5.5pc5.5pc7pc7apcapcapc-a700apc-a700apc-a750apc-a750pacbluepacbluekro多種熒光素為多色分析提供了可能多種熒光素為多色分析提供了可能 不同公司的熒光染料強度比較不同公司的熒光染料強度比較bcbdebiosciencebiolegenddakolife technologiespacific bluepacific blue, v450, bv421efluor450bv421p

14、acific bluepacific bluekrome orangeamcyan, v500-bv570cascade yellowpacific orangefitc, alexa488fitc, alexa488fitc, alexa488fitc, alexa488fitcfitc, alexa488pe, rd1pepeper-pepeecdpecf594-pe-tr, pe-a610pc5.5percp, percpcy5.5percp, (percpcy5.5), percp-efluor710percp, percpcy5.5percp, pecy5percp, tricolo

15、r, pecy5.5, pea700pc7pecy7pecy7pecy7-pecy7apc / alexa647apc, alexa647apc, alexa647,efluor660apc, alexa647apc apc, alexa647apca700a700a700a700-apccy5.5apca750apccy7, apch7apcefluor780apccy7-apca750(brightest on channel)krome krome orangeorange熒光素的熒光強度熒光素的熒光強度cd8 conjugatesfitcfitcpepeecdecdpc5pc5pecy

16、5.5pecy5.5pc7pc7apcapc(various) (various) alexa 700alexa 700pacific pacific blueblue488nm (blue)638nm (red)405nm (violet)(lt) pacific (lt) pacific orangeorange(bd)apc-h7(bd)apc-h7apcalexa apcalexa 750750apcalexa apcalexa 700700sn 值（值（signal/noise）bc 熒光染料熒光染料 染色指數染色指數source: dartlab; http:/www.dartmo

17、uth.edsn信噪比信噪比:mfi(pos) / mfi(neg),420.15/0.37 = 1136si染色指數染色指數:(mfi(pos)-mfi(neg)/2*sd(neg),(420.15-0.37)/2*0.23 = 913最大程度反映了對于同一熒光染最大程度反映了對于同一熒光染料的不同儀器的性能料的不同儀器的性能bc 熒光染料熒光染料 染色指數染色指數熒光素的特性熒光素的特性 crosstalk（串色）（串色）crosstalk index（串色指數）:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100ci: 2.

18、71 / 1278.24 = 0.21ci: 69.46 / 1278.24 = 5.43ci: 578.48 / 1278.24 = 45.26ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47(0.84/0.31)/(421.82/0.33)串色指數由熒光染料本身的特性決定串色指數由熒光染料本身的特性決定crosstalk index:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100熒光素的特性熒光素的特性 crosstalk(串色指數串色指數)ci: 2.71 / 1278.24 = 0.21cf: 0.1ci: 69

19、.46 / 1278.24 = 5.43cf: 5.97ci: 578.48 / 1278.24 = 45.26cf: 31.28ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47cf: 5.97cf: compensation factorcfci 熒光素特性熒光素特性 - crosstalkcrosstalk index:sn(mfi(secondary channel) / sn(mfi(primary channel) * 100彌散程度大彌散程度大ci: 2.71 / 1278.24 = 0.21cf: 0.1ci: 69.46 / 1278.24 = 5.43cf: 5.97c

20、i: 578.48 / 1278.24 = 45.26cf: 31.28ci: 108.29 / 1278.24 = 8.47cf: 5.97數字化熒光補償數字化熒光補償通過通過logicle logicle 進行線性補救進行線性補救 ( (在低對數通道進行線性壓縮在低對數通道進行線性壓縮) )未補償未補償: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(pos) sd(neg)mfi(pos) mfi (neg) mfi(pos) mfi (neg) fl3fl3fl3fl3部分補償部分補償: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(

21、pos) sd(neg)mfi(pos) mfi (neg) mfi(pos) mfi (neg) fl3fl3fl3 median(pepos) = fl3 median fl3 median(pepos) = fl3 median (peneg)(peneg)正確補償后正確補償后: :sdsdcvcv= =mfimfisd(pos) sd(neg)sd(pos) sd(neg)mfi(pos) = mfi (neg) mfi(pos) = mfi (neg) 34%46%62%對于既定的熒光素，它有固定的發射波長，熒光補償數值只反映相對的對于既定的熒光素，它有固定的發射波長，熒光補償數值只

22、反映相對的pmtpmt的電壓的電壓. .熒光補償熒光補償405nm638nm“激光內”熒光補償488nm熒光補償熒光補償405nm638nm488nm熒光補償熒光補償“激光間”熒光補償 its just numbers !熒光補償熒光補償10 10 色色 distortion distortion 圖譜圖譜(gallios, navios) (gallios, navios) distortion 矩陣矩陣s i l e n tu n t o u c h a b l euntouchable =untouchable =其他染料沒有干擾其他染料沒有干擾(clean row)(clean row

23、)silent =silent =不會漏進其他通道不會漏進其他通道(clean column)(clean column)distortion 矩陣矩陣u n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l es i l e n tu n t o u c h a b l edistortion 矩陣矩陣untouchable =其他染料沒有干擾(clean row)silent =不會漏進其他通道(clean column)u n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l eu n t o u c h a b l es i l e n

24、ts i l e n ts i l e n tdistortion 矩陣矩陣untouchableuntouchable =其他染料沒有干擾(clean row)silentsilent =不會漏進其他通道(clean column)抗原間的關系抗原間的關系 互相排斥互相排斥 互相排斥的標志可以為對方提供dump 通道unaffected limitsfor cd4-/cd8- cells抗原間的關系抗原間的關系 共表達共表達ecd+/pc5.5+的的細細胞群在胞群在 pc7 通道內通道內陰陽性界限向右移陰陽性界限向右移共表達能夠影響overspill 通道陰性群的分布 cd27-pc7（lo

25、gicle view）(logarithmic view)抗原間的關系抗原間的關系 親代和子代親代和子代 是共表達和相互排斥的結合體是共表達和相互排斥的結合體這里的排斥是單向的，也可解釋為沒有共表達這里的排斥是單向的，也可解釋為沒有共表達 compensated uncompensated 正確地確定子代和親代的位置能夠確保更好的結果。正確地確定子代和親代的位置能夠確保更好的結果。抗原間的關系抗原間的關系 親代和子代親代和子代抗原分布抗原分布 分群明顯分群明顯 vs 連續表達連續表達b cellsactivated t8 cells達到最佳抗體組合的達到最佳抗體組合的6 6大法則大法則弱表達抗

26、原選擇強熒光染料，強表達抗原選擇弱熒光染料(“老法則”)細胞內抗原（有空間位阻）檢測優先選擇小分子熒光素多色檢測時弱表達抗原放在被干擾較小（untouchable）的檢測通道，強表達抗原放在對其他通道干擾較小（silence）的檢測通道 表達互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測通道共表達的抗原避免放在相互干擾的通道上級抗原檢測通道避免對下級抗原檢測通道造成干擾使分析的復雜程度降到最低使分析的復雜程度降到最低淋巴瘤淋巴瘤- 1-2 - 1-2 系別抗原系別抗原- - 已知表型，但有不典型表現已知表型，但有不典型表現 - - 有些是互相排斥的表型有些是互相排斥的表型表達強度表達強度表達方式表達

27、方式染料染料/ / 通道通道分類分類表達方式表達方式染料染料/ /通道通道分類分類表達強度表達強度表達方式表達方式染料染料/ /通道通道分類分類免疫監測免疫監測- - 多系抗原多系抗原- - 大部分是已知抗原大部分是已知抗原白血病白血病- - 異常系別抗原異常系別抗原-抗原表達強度差別大抗原表達強度差別大- - 表型變化大表型變化大不同應用對抗體組合設計的影響不同應用對抗體組合設計的影響表達強度表達強度不洗滌過程不洗滌過程制備過程對制備過程對distortion 矩陣的影響矩陣的影響不洗滌過程加快數據分析不洗滌過程加快數據分析錯誤的抗體組合即使是進行洗滌也無法得到好的結果！錯誤的抗體組合即使是

28、進行洗滌也無法得到好的結果！ no washwash樣本制備過程對檢測的影響樣本制備過程對檢測的影響抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！分析目標細胞群分析目標細胞群: cd3+cd4+cd25+ / cd3+cd4+cd38+: cd3+cd4+cd25+ / cd3+cd4+cd38+cd3+cd8+cd25+ / cd3+cd8+cd38+cd3+cd8+cd25+ / cd3+cd8+cd38+ 抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！fitcpeecdpc5.5pc7apcapcaf700apca750pacb

29、luekrorangecd4cd184cd69cd25cd279cd8cd127cd3cd57cd45抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！fitcpeecdpc5.5pc7apcapcaf700apca750pacbluekrorangecd57cd184cd8cd25cd279cd69cd127cd45cd4cd3抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！抗體組合設計很大程度上會影響你的結果！lets do some sensitivity workout !實驗部分（“ 表型分析”）u人的人的edtaedta抗凝全血抗凝全血u單標熒光補償抗體：單標熒光補

30、償抗體： cd8-fitc, cd3-pe, cd5-ecd, cd19-cd8-fitc, cd3-pe, cd5-ecd, cd19-pc5.5pc5.5， cd5-pc7cd5-pc7，cd4-apc, cd8-apca700cd4-apc, cd8-apca700，cd3-apca750, cd3-apca750, cd3-pb, cd4-kocd3-pb, cd4-kou10c10c抗體組合（驗證管）：抗體組合（驗證管）：cd16-fitc,cd127-pe,cd19-cd16-fitc,cd127-pe,cd19-ecd,cd25-pc5.5ecd,cd25-pc5.5， cd56

31、-pc7cd56-pc7，cd4-apc,cd8-apca700cd4-apc,cd8-apca700，cd3-cd3-apca750apca750，hla-dr-pb,cd45-kohla-dr-pb,cd45-kou溶血素溶血素10c 方案方案-樣本制備樣本制備u標記標記1212支試管，分別為陰性對照，單色補償和支試管，分別為陰性對照，單色補償和1010色。色。u分別不同試管里加入對應的單色補償試劑和分別不同試管里加入對應的單色補償試劑和1010色混合試劑，色混合試劑，陰性對照管不加抗體，室溫暗處孵育陰性對照管不加抗體，室溫暗處孵育1515分鐘分鐘uoptilyse c optilyse

32、c 溶血素溶血溶血素溶血1010分鐘分鐘u加入加入pbs 300gpbs 300g離心離心5 5分鐘，棄上清，加入分鐘，棄上清，加入500ul pbs500ul pbs上機檢測。上機檢測。樣本制備樣本制備u陰性對照管調節電壓，用陰性對照管調節電壓，用flow-set 標準微球標準化標準微球標準化pmt.上機檢測上機檢測根據標準化信號（根據標準化信號（ flow-set beads flow-set beads ）對特異的應用和染料進行）對特異的應用和染料進行pmtpmt電壓的調整。電壓的調整。 標準化儀器設置可以確保可重復結果。標準化儀器設置可以確保可重復結果。( (質控血質控血) )儀器校準

33、和標準化儀器校準和標準化( (質控血質控血) )儀器校準和標準化儀器校準和標準化標準化儀器設置可以確保可重復結果。標準化儀器設置可以確保可重復結果。an26093as19123at13106儀器校準和標準化儀器校準和標準化u單標樣本自動做熒光補償。單標樣本自動做熒光補償。u10c結果分析。結果分析。上機檢測上機檢測篩選組合篩選組合成熟/ 淋巴細胞篩選:不成熟 / 急性白血病篩選:small samples :目的目的: : 識別如下細胞群:t cells: t cells: cd8+t cells; t regs; nave and central memory cd4+t cells; effector cd4+t cells; nk cellsnk