1、基因工程實驗1 基因工程大實驗基因工程大實驗e.coli 感受態細胞的制備、質粒感受態細胞的制備、質粒dna的轉化、的轉化、提取與酶切鑒定提取與酶切鑒定基因工程實驗2 一、一、 實驗目的和要求實驗目的和要求 1、通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感、通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞和質粒受態細胞和質粒dna轉化受體菌細胞的原理與技術；轉化受體菌細胞的原理與技術；2、了解質粒、了解質粒dna的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細胞中分離、提取質粒胞中分離、提取質粒dna的方法；的方法；3、掌握限制性內切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳、掌握限制性內

2、切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法；的操作方法； 通過本實驗了解大腸桿菌感受態細胞制備、通過本實驗了解大腸桿菌感受態細胞制備、dna轉化、限制性內切酶在分子生物學研究中的意義與作轉化、限制性內切酶在分子生物學研究中的意義與作用。用。基因工程實驗3 二、實驗原理二、實驗原理 1、感受態細胞制備、感受態細胞制備:所謂感受態是指受體細胞處于容易吸所謂感受態是指受體細胞處于容易吸收外源收外源dna的一種生理狀態，可以通過物理與化學方法誘導的一種生理狀態，可以通過物理與化學方法誘導形成，也可以自然形成，在基因工程技術中通常采用誘導的形成，也可以自然形成，在基因工程技術中通常采用誘導的方法。用于轉

3、化的受體菌細胞一般是限制方法。用于轉化的受體菌細胞一般是限制-修飾系統修飾系統（restriction-modification）缺陷的變異株，以防止對導入的）缺陷的變異株，以防止對導入的外源外源dna的切割，用符號的切割，用符號r-m-表示。其基本原理是：細菌處表示。其基本原理是：細菌處于于0的的cacl2低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性低滲溶液中，會膨脹成球形，細胞膜的通透性發生變化，轉化混合物中的質粒發生變化，轉化混合物中的質粒dna形成抗形成抗dnase的羥基的羥基-鈣鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，經磷酸復合物黏附于細胞表面，經過過42短時間的熱激處理，短時間的熱激處理，基因工程

4、實驗4 促進細胞吸收促進細胞吸收dna復合物，在豐富的培養基上生長數小時后，復合物，在豐富的培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養基上可獲得所需的轉化球狀細胞復原并分裂增殖，在選擇培養基上可獲得所需的轉化子。子。 2、堿裂解法小量制備質粒、堿裂解法小量制備質粒dna：堿裂解法是基于線性大：堿裂解法是基于線性大分子染色體分子染色體dna與小分子環形質粒與小分子環形質粒dna的變性、復性的差異的變性、復性的差異達到分離目的的，在達到分離目的的，在ph12.012.6的堿性環境中，線型染色體的堿性環境中，線型染色體dna和環型質粒和環型質粒dna氫鍵會發生斷裂，雙鏈解開而變性，但氫

5、鍵會發生斷裂，雙鏈解開而變性，但質粒質粒dna由于其閉合環型結構，氫鍵僅發生部分斷裂，而且由于其閉合環型結構，氫鍵僅發生部分斷裂，而且其互補鏈不完全分離；當將其互補鏈不完全分離；當將ph值調節到中性并在高鹽濃度下，值調節到中性并在高鹽濃度下，已分開的染色體已分開的染色體dna互補鏈不能復性而交聯形成不溶的網狀互補鏈不能復性而交聯形成不溶的網狀結構，通過離心，大部分染色體結構，通過離心，大部分染色體dna、不穩定的大分子、不穩定的大分子rna和蛋白和蛋白基因工程實驗5 質質-sds復合物等一起沉淀下來而被除去，而部分變性的閉合復合物等一起沉淀下來而被除去，而部分變性的閉合環狀的質粒環狀的質粒dn

6、a在中性條件下很快復性，恢復到原來的構型，在中性條件下很快復性，恢復到原來的構型，呈可溶性狀態保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的呈可溶性狀態保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質粒質粒dna。 3、限制性內切酶：又稱為內切酶或限制酶，是一類能、限制性內切酶：又稱為內切酶或限制酶，是一類能識別雙鏈識別雙鏈dna分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的dna水解酶，是體外剪水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。基因工程實驗6 處的處的dna。類限制性內切酶在識別位點上切割，類限制性內切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下

7、來。故然后從底物上解離下來。故類和類和限制酶在基因工程中基本限制酶在基因工程中基本不用，不用，ii類酶在分子克隆中使用廣泛，其基本特點如下：類酶在分子克隆中使用廣泛，其基本特點如下： (1)、專一性地識別并切割特定的核苷酸序列，如、專一性地識別并切割特定的核苷酸序列，如ecor i識識別與切割序列為別與切割序列為5gaattc3 3cttaag5 (2) 、識別的核苷酸數目大多數為、識別的核苷酸數目大多數為46個，少數識別個，少數識別813個；個； (3)、識別序列大多數為二重對稱（回文序列），大多數酶、識別序列大多數為二重對稱（回文序列），大多數酶產生的是具有凸出的粘性末端：產生的是具有凸出

8、的粘性末端：基因工程實驗7 (4)、有不同來源的限制性內切酶可以識別相同的序列，甚至切割的位點也相同，稱、有不同來源的限制性內切酶可以識別相同的序列，甚至切割的位點也相同，稱為同裂酶或異源同工酶，如為同裂酶或異源同工酶，如hpa ii與與msp i；有的識別位點不同，但對；有的識別位點不同，但對dna切割后可切割后可產生相同的粘性末端，稱為同尾酶，如產生相同的粘性末端，稱為同尾酶，如bamh i與與bgl ii。基因工程實驗8 影響核酸限制性內切酶活性的因素：影響核酸限制性內切酶活性的因素： dnadna的純度；的純度； dnadna的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反應的溫度；酶切消化反

9、應的溫度； dnadna的分子結構；的分子結構； 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類； 緩沖液的緩沖液的 phph值。值。 4、瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳: 瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質小與孔隙度的固體基質 (密度與瓊脂糖濃度相關密度與瓊脂糖濃度相關)；而生理條件下，核酸分子；而生理條件下，核酸分子的糖的糖-磷酸骨架中磷酸基團呈離子化狀態，因此將核酸分子置于電場中時，磷酸骨架中磷酸基團呈離子化狀態，因此將核酸分子置于電場中時，它們會向正極遷移，由于糖它們會向正極遷移，由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性，相同數

10、量的雙鏈磷酸骨架在結構上的重復性，相同數量的雙鏈dna幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場強度下，在一定的電場強度下，dna分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構象。分子量較小的象。分子量較小的dna分子，比分子量較大的分子，比分子量較大的dna分子，具有較緊密的構分子，具有較緊密的構型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環型，所以其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環dna分子或線分子或線性性dna分子要快。直接用低濃度的分子要快。直接用

11、低濃度的eb進行染色，可確定進行染色，可確定dna在膠中的位置。在膠中的位置。 基因工程實驗9 影響瓊脂糖凝膠電泳影響瓊脂糖凝膠電泳dna遷移率的因素：遷移率的因素： dna的分子大小；的分子大小； 瓊脂糖濃度；瓊脂糖濃度； dna構象；構象； 電場強度；電場強度； 堿基組成與溫度；堿基組成與溫度； 嵌入染料的存在；嵌入染料的存在； 電泳緩沖液的組成。電泳緩沖液的組成。 三、實驗材料與設備：三、實驗材料與設備：1、用品與與儀器：、用品與與儀器： 超凈工作臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、恒溫培養箱、恒溫振蕩器、超凈工作臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、恒溫培養箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺式

12、冷凍高速離心機、旋渦震蕩器、電泳儀、移液器、微型離心管等、臺式冷凍高速離心機、旋渦震蕩器、電泳儀、電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機等；電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機等； 1.5ml 與與0.5ml eppendorf 管、管、tip頭頭 、燒杯、量筒、燒杯、量筒基因工程實驗10 鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、 吸水吸水紙，一次性塑料手套等；紙，一次性塑料手套等； e.coli dh5受體菌受體菌(r-m-)， ptre2hyg質粒質粒(ampr) lb培養基培養基:蛋白胨蛋白胨 10g/l，酵母提取物，酵母

13、提取物 5g/l， nacl 10g/l，瓊脂粉，瓊脂粉 15g/l（固體培養基），用（固體培養基），用10 mol/l的的naoh調節調節ph為為7.0，高壓滅菌；，高壓滅菌； 氨芐青霉素貯存液：濃度氨芐青霉素貯存液：濃度50-100mgml； 含有抗菌素的含有抗菌素的lb平板培養基：將配置好的平板培養基：將配置好的lb固體培養基固體培養基高壓滅菌后，冷卻到高壓滅菌后，冷卻到60度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為50gml濃度濃度50-100gml）；）；基因工程實驗11 0.1mol/lcacl 0.1mol/lcacl2 2：稱取：稱取1.1g1.1g進口無

14、水進口無水caclcacl2 2，溶于，溶于70ml70ml雙蒸雙蒸水中，定容到水中，定容到100ml100ml，過濾后滅菌；，過濾后滅菌； 0.1mol/lcacl0.1mol/lcacl2 2 1515甘油：甘油：100ml 0.1mol/l cacl100ml 0.1mol/l cacl2 2 溶液內溶液內含有含有15ml15ml甘油，高壓滅菌；甘油，高壓滅菌； 溶液溶液i: 50mmol/li: 50mmol/l葡萄糖，葡萄糖，10mmol/l edta (ph8.0)10mmol/l edta (ph8.0)， 25mmol/l tris-hcl (ph8.0)25mmol/l tr

15、is-hcl (ph8.0)； 溶液溶液ii: 0.2mol/l naoh, 1%sds (ii: 0.2mol/l naoh, 1%sds (現配現用現配現用) )； 溶液溶液iii: iii: 乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3m, ph=4.8)( 60ml(3m, ph=4.8)( 60ml的的5mol/l kac, 5mol/l kac, 11.5ml 11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5ml h2o)28.5ml h2o)； rnase arnase a： 10mg/ml10mg/ml； tete緩沖液緩沖液: 10mmol/l: 10mmol/l，tris-hcl, 1mmol/ltri

16、s-hcl, 1mmol/l，edtaedta，ph ph 8.08.0； 基因工程實驗12 5tbe緩沖液：緩沖液：0.45mol/l tris硼酸，硼酸，0.01 mol/l edta, ph 8.0； 10loading buffer：1% sds, 0.05%溴酚蘭，溴酚蘭，50的甘油；的甘油； 無水乙醇；無水乙醇； 7070乙醇；乙醇； 標準分子量片段；標準分子量片段； 核酸內切酶核酸內切酶 ecor i (takara)； ecor i酶解緩沖液酶解緩沖液(10 buffer h)； 瓊脂糖；瓊脂糖； 溴化乙啶（溴化乙啶（eb）染色液）染色液(10mg/ml)。基因工程實驗13 四

17、、操作步驟四、操作步驟: (一一) 感受態細胞的制備：感受態細胞的制備： 1、從新活化的、從新活化的e.coli dh5平板上挑取一單菌落，接種于平板上挑取一單菌落，接種于35ml lb液體培養中，液體培養中，37振蕩培養至對數生長期振蕩培養至對數生長期(12h左左右右)； 2、將該菌懸液以、將該菌懸液以1:1001:50轉接于轉接于100ml lb液體培養液體培養基中，基中，37振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔振蕩擴大培養，當培養液開始出現混濁后，每隔2030min測一次測一次od600，至，至od600為為0.30.5時停止培養，時停止培養，并轉裝到并轉裝到1.5 ml離心管中；

18、離心管中； 3、培養物于冰上放置、培養物于冰上放置20min； 4、 04，4000g離心離心10min，棄去上清液，加入，棄去上清液，加入1 ml冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液，小心懸浮細胞溶液，小心懸浮細胞, 冰浴冰浴20分鐘；分鐘；基因工程實驗14 cacl2純度至關重要，不同廠家，純度至關重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號的產品均影響感受態的轉化效率甚至同一廠家不同批號的產品均影響感受態的轉化效率 5、04， 4000g離心離心10min，倒凈上清培養液，再用，倒凈上清培養液，再用1.0 ml冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液溶液輕輕懸浮輕輕懸浮細胞，冰浴細胞，冰

19、浴20min； 6、 04， 4000g離心離心10min，棄去上清液，加入，棄去上清液，加入100 l冰冷的冰冷的0.1mo1l cacl2溶液，溶液，小心懸浮細胞小心懸浮細胞，冰上放置，冰上放置片刻后，即制成了感受態細胞懸液；片刻后，即制成了感受態細胞懸液； 7、制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，、制備好的感受態細胞懸液可直接用于轉化實驗，如果在如果在4放置放置1224h，其轉化效率可以增高，其轉化效率可以增高46倍倍；也可加入占；也可加入占總體積總體積15左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心離心管中，置于管中，置于-70條件下，可保存

20、半年至一年條件下，可保存半年至一年。基因工程實驗15 （二）質粒（二）質粒dna的轉化：的轉化： 1、每、每100l感受態細胞懸液中加入感受態細胞懸液中加入1l質粒質粒dna,輕輕搖勻，輕輕搖勻，同時設置三組對照：同時設置三組對照：(1)不加質粒，不加質粒，(2)不加受體菌，不加受體菌， (3)加已加已知具有轉化活性的質粒知具有轉化活性的質粒dna，具體操作按下表進行：具體操作按下表進行：*陽性對照，用已知具有轉化活性的ptre2hyg質粒dna進行轉化 編號編號組組 別別質粒質粒dna/lte buf / l0.1mol/l cacl2 / l受體菌受體菌/ l1受體菌對照受體菌對照1100

21、2質粒對照質粒對照1（ g）1003轉化組轉化組i1（ g）1004轉化組轉化組ii *1（ g）100基因工程實驗16 2、冰上放置、冰上放置2030min，然后，然后42水浴熱激水浴熱激90120 sec，迅速冰上冷卻迅速冰上冷卻2min； 3、 立即向上述立即向上述ep管中加入管中加入0.8ml lb液體培養基，搖勻液體培養基，搖勻后于后于37振蕩培養約振蕩培養約1530min ，使受體菌恢復正常生長狀，使受體菌恢復正常生長狀態及表達抗性基因；態及表達抗性基因； 4、取培養液、取培養液50l接種于含抗菌素的接種于含抗菌素的lb平板培養基上，平板培養基上，用玻璃涂棒涂勻；用玻璃涂棒涂勻；

22、5、將培養皿放在、將培養皿放在37恒溫培養箱培養恒溫培養箱培養30 min,待菌液完待菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，于全被培養基吸收后，倒置培養皿，于37恒溫培養箱內培養恒溫培養箱內培養過夜過夜(14-16h) ；（三）堿裂解法小量制備質粒（三）堿裂解法小量制備質粒dna:基因工程實驗17 1、挑取轉化篩選的帶有目的質粒的大腸桿菌接種到液體培養基中，、挑取轉化篩選的帶有目的質粒的大腸桿菌接種到液體培養基中，37震蕩培養震蕩培養1216小時；小時； 2、將、將1.5ml菌液加入菌液加入ep離心管中，離心管中，12000 g離心離心30 sec，棄上清液，棄上清液，在吸水紙上扣干；在吸水紙上

23、扣干； 離心時間不能太長，以免影響下一步的菌體懸浮。離心時間不能太長，以免影響下一步的菌體懸浮。 3、加入、加入100 l預冷的溶液預冷的溶液i ，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細菌細胞，盡，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細菌細胞，盡量使細胞分散；量使細胞分散； 溶液溶液i中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，減少提取過程中的機械中的葡萄糖的作用是增大溶液的粘度，減少提取過程中的機械剪切力，防止染色體剪切力，防止染色體dna 的斷裂；的斷裂；edta的作用是與二價離子（的作用是與二價離子（ca2）結合，降低結合，降低dnase對對dna的降解。的降解。 4、加入、加入200 l新配制的溶液新配制的溶液ii, 蓋緊

24、管口蓋緊管口,快速顛倒離心管快速顛倒離心管,以混勻內容以混勻內容物物,冰上放置冰上放置35min; 溶液溶液ii中的中的naoh與與sds可裂解細胞，使可裂解細胞，使dna變性以及變性以及sds使蛋白變性使蛋白變性并形成交聯的網狀結構。并形成交聯的網狀結構。基因工程實驗18 5、加入、加入150 l溶液溶液iii, 加蓋后顛倒加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置次混勻，冰上放置23min； 溶液溶液iii為低為低ph的醋酸鉀緩沖液，中和的醋酸鉀緩沖液，中和naoh，以便使部，以便使部分變性的閉環質粒復性，而細菌染色體分變性的閉環質粒復性，而細菌染色體dna不能正確復性。不能正確復性。 6、1200

25、0 g離心離心6 min，將上清移入另一干凈的，將上清移入另一干凈的ep管中；管中； 7、加、加2倍上清體積倍上清體積(約約1ml)的無水乙醇的無水乙醇, 振蕩混勻，室溫振蕩混勻，室溫放置放置2min. 8、 12000g離心離心10min，棄上清液，再用，棄上清液，再用70的乙醇洗的乙醇洗滌一次，滌一次， 12000g離心離心1min，離心管倒置于吸水紙上扣干，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在中空濃縮系統上干燥質粒；然后在中空濃縮系統上干燥質粒； 9、加入、加入40 l含含20 g/ml rnase a的滅菌蒸餾水或的滅菌蒸餾水或te 緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質粒完全溶解緩沖液溶解提取

26、物，室溫放置直到質粒完全溶解(約約8min)，存于存于20或直接用于酶切。或直接用于酶切。基因工程實驗19 基因工程實驗20 (四四)提取質粒的酶切鑒定與瓊脂糖凝膠電泳：提取質粒的酶切鑒定與瓊脂糖凝膠電泳： 1、在、在0.5ml ep管中依次加入下列溶液于管中依次加入下列溶液于0.5ml離心管中離心管中 提取質粒提取質粒dna 3.0 l 10 buffer h 1.0 l ecor i 2.0 u dd h2o 5.8 l 10 l 1u: 1單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下，在單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下，在20 l 反反應液中反應應液中反應1h，使，使1 g dna完全消

27、化所需的酶量完全消化所需的酶量. 2、 輕輕混勻輕輕混勻, 4000g離心離心10秒秒 ，置于，置于37水浴中酶解水浴中酶解1.5h。 3、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入1.2 l 10上樣緩沖液上樣緩沖液(或或2 l 6上樣緩沖上樣緩沖液液), 混勻混勻. 4、稱取、稱取1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml 0.5tbe或或1tae緩沖液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至緩沖液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。瓊脂糖溶解。基因工程實驗21 5、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60左右的瓊脂糖凝膠液左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴加入一小滴eb，小心混勻，倒到制膠槽上，直到在整個有機玻璃板，