1、項目導入：項目導入：vero細胞和狂犬病毒的培養工藝細胞和狂犬病毒的培養工藝dmem培養基培養基胎牛血清胎牛血清其他成分其他成分錐形瓶逐級錐形瓶逐級放大培養放大培養加堿（碳酸加堿（碳酸氫鈉）氫鈉）加糖（葡萄加糖（葡萄糖）糖）灌注培養液灌注培養液微載體微載體5l種子罐培種子罐培養養培養液培養液50l生生物物反反應應器器接種狂犬接種狂犬病毒病毒出液口出液口收獲病毒收獲病毒動物細胞培養、動物細胞培養、 動物細胞融合、動物細胞融合、單克隆抗體、胚胎移植、動物細胞核移植等單克隆抗體、胚胎移植、動物細胞核移植等動物細胞培養技術動物細胞培養技術是其他動物細胞工程技術的基礎。是其他動物細胞工程技術的基礎。提問

2、：提問：v植物細胞工程常用的技術手段有哪些？植物細胞工程常用的技術手段有哪些？植物組織培養植物組織培養, 植物體細胞雜交植物體細胞雜交v動物細胞工程常用的技術手段有哪些？動物細胞工程常用的技術手段有哪些？動物細胞培養和核移植技術動物細胞培養和核移植技術 動物細胞培養就是從動物機體內取出相關的組織，動物細胞培養就是從動物機體內取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基將它分散成單個細胞，然后，放在適宜的培養基中，讓這些細胞生長和增殖。中，讓這些細胞生長和增殖。1、選材：、選材： 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，動物胚胎或幼齡動物的組織、器官，它們細胞增殖能力強，分裂旺盛，分它們細

3、胞增殖能力強，分裂旺盛，分化程度低，容易培養。化程度低，容易培養。v在進行動物細胞培養時，用在進行動物細胞培養時，用胰蛋白酶胰蛋白酶分散分散細胞，說明細胞間的物質主要是細胞，說明細胞間的物質主要是蛋白質蛋白質。動。動物細胞培養適宜的物細胞培養適宜的ph為為7.27.4，此環境下，此環境下胃蛋白酶（胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。的活性較高。2.分散成單個細胞分散成單個細胞3.動物細胞生長特性動物細胞生長特性： 細胞貼壁：細胞貼壁： 懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。稱為細胞貼壁。要求：

4、要求： 培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼培養瓶或培養皿的內表面光滑、無毒、易于貼附。附。細胞的接觸抑制細胞的接觸抑制： 當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑就會停止分裂增殖，這種現象稱為細胞的接觸抑制。制。 4.4.過程：過程：細胞細胞懸浮懸浮液液1010代代細胞細胞5050代代細胞細胞無限無限傳代傳代原代培養原代培養傳代培養傳代培養細胞株細胞株細胞系細胞系5.5.如何界定原代培養和傳代培養；細胞株和細胞如何界定原代培養和傳代培養；細胞株和細胞系？系？多數組織細胞固定在表面多數組織細胞固定在表面生長和

5、分裂。生長和分裂。隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖隨細胞增多，細胞就會停止分裂增殖遺傳物質改變遺傳物質改變動物動物胚胎胚胎或或幼齡幼齡動動物的組織、器官物的組織、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎單個細胞單個細胞加培養液加培養液制成制成細胞細胞懸浮懸浮液液細胞株細胞株細胞系細胞系細胞增值細胞增值無限傳代無限傳代去掉組織去掉組織間蛋白間蛋白動物細胞培養不能動物細胞培養不能最終培養成生物體最終培養成生物體動物細胞培養條件：動物細胞培養條件：1、無菌、無毒的環境、無菌、無毒的環境 （添加一定量的抗生素，定期更換培養液）（添加一定量的抗生素，定期更換培養液）2、營養、營養（葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動

6、物血清等。葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素、動物血清等。）3、溫度和、溫度和ph 36.5+（-）0.5度, 7.2-7.44、氣體環境：、氣體環境： o2和和co2（95%空氣和空氣和5% co2 ）保證細胞順利的保證細胞順利的生長增殖生長增殖動物細胞培養液的主要成分：動物細胞培養液的主要成分：葡萄糖葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和、氨基酸、無機鹽、維生素和動物動物血清血清等。等。與植物培養基相比其特點是：與植物培養基相比其特點是：（1 1）液體培養基）液體培養基（2 2）含有動物血清）含有動物血清動物體細胞大都生動物體細胞大都生活在活在液體液體的環境的環境2.2.動物細胞培養技術的應用動物細

7、胞培養技術的應用（1 1）生產蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾）生產蛋白生物制品：病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等。素、單克隆抗體等。（3 3）用于檢測有毒物質）用于檢測有毒物質（2 2）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。）獲得大量自身的皮膚細胞，用于植皮。（4 4）用于生理、病理、藥理等方面的研究，）用于生理、病理、藥理等方面的研究，為治療和預防疾病提供理論依據為治療和預防疾病提供理論依據細胞的全能性細胞的全能性細胞株、細胞系細胞株、細胞系植物體植物體培養結果培養結果獲得細胞獲得細胞或或細胞產物細胞產物快速繁殖、培育快速繁殖、培育無病毒植株等無病毒植株等培養目的培養目的葡萄糖、動葡萄糖、動物血清物

8、血清蔗糖、植物蔗糖、植物激素激素培養基特有成分培養基特有成分液體培養基液體培養基固體培養基固體培養基培養基性質培養基性質細胞增殖細胞增殖原理原理動物細胞培養動物細胞培養植物組織培養植物組織培養比較項目比較項目植物細胞和動物細胞培養的比較植物細胞和動物細胞培養的比較1.1.過程：過程：誘導方式誘導方式物理法物理法化學法化學法生物法：生物法： 滅活的病毒滅活的病毒仙臺病毒仙臺病毒紫外線紫外線喪失感染性喪失感染性（不感染細胞）（不感染細胞）保留融合活性保留融合活性 （誘導細胞融合）（誘導細胞融合）1.1.過程：過程：滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面細胞膜被病毒顆粒穿通細胞膜被

9、病毒顆粒穿通細胞膜連接細胞膜連接細胞融合，形成雜種細胞細胞融合，形成雜種細胞（細胞膜具有一定的流動性）（細胞膜具有一定的流動性）主要用于制備主要用于制備單克隆抗體單克隆抗體獲得雜種植株獲得雜種植株用途用途物理、化學方法物理、化學方法（同左）（同左）滅活的病毒滅活的病毒物理（離心、物理（離心、振動振動、電刺激）電刺激）化學（聚乙二醇）化學（聚乙二醇）誘導方法誘導方法使細胞分散后誘使細胞分散后誘導細胞融合導細胞融合去除細胞壁后誘去除細胞壁后誘導原生質體融合導原生質體融合細胞融合的方法細胞融合的方法細胞膜的流動性細胞膜的流動性細胞膜的流動性、細胞膜的流動性、植物細胞全能性植物細胞全能性原理原理動物細

10、胞融合動物細胞融合植物體細胞雜交植物體細胞雜交比較項目比較項目植物、動物細胞融合的比植物、動物細胞融合的比較較 抗體抗體1 1。抗原抗原 動物體內動物體內刺激刺激效應效應b 抗原抗原 動物體內動物體內刺激刺激效應效應b 抗體抗體抗原不純抗原不純抗體不純抗體不純篩選單一效應篩選單一效應b細胞細胞不能增值產生大量抗體不能增值產生大量抗體2 2。特異性差、純度低；。特異性差、純度低； 產量低、反應不夠靈敏產量低、反應不夠靈敏設計方案：設計方案：一個一個b b淋巴細胞只分泌一種特異性抗體淋巴細胞只分泌一種特異性抗體小鼠骨髓瘤細胞能無限增殖小鼠骨髓瘤細胞能無限增殖- -化學性質單一、特異性強的抗體。化學

11、性質單一、特異性強的抗體。雜種細胞雜種細胞 ？ ？誘導其融合的誘導其融合的方法有哪些？方法有哪些？ 抗原抗原 效應效應b細胞細胞2.2.制備過程：制備過程：除通過雜交瘤細胞產生單克隆除通過雜交瘤細胞產生單克隆抗體外，還有什么方法？抗體外，還有什么方法？3. 3.單克隆抗體的應用：單克隆抗體的應用： 在基礎理論研究中具有重要意義在基礎理論研究中具有重要意義 在疾病診斷、治療和預防方面，具有在疾病診斷、治療和預防方面，具有特異性高、靈敏度高等優越性。特異性高、靈敏度高等優越性。生物導彈生物導彈一種誘導細胞融合的新方法一種誘導細胞融合的新方法一種新細胞一種新細胞滅活病毒滅活病毒雜交瘤細胞雜交瘤細胞一

12、個優勢一個優勢單克隆抗體特異性強、單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優勢靈敏度高的優勢動物的胚胎移植動物的胚胎移植 解決某些妊解決某些妊娠時間長、每胎娠時間長、每胎產子數量少的優產子數量少的優良種畜的繁殖速良種畜的繁殖速度問題。度問題。二、動物體細胞核移植技術二、動物體細胞核移植技術:將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經去掉將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成一個新細胞核的卵母細胞中，使其重組并發育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發育成動物個體。的胚胎，這個新的胚胎最終發育成動物個體。用核移植的方法得到的動物用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物稱為克隆動

13、物核移植核移植胚胎細胞核移植胚胎細胞核移植體細胞核移植體細胞核移植（難度高難度高）受體細胞：受體細胞：m期的期的卵母細胞卵母細胞多莉與多莉與“母親母親”卵細胞卵細胞母綿羊母綿羊母綿羊母綿羊乳腺細胞乳腺細胞細胞質細胞質細胞核細胞核細胞核移植細胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂c母綿羊子宮母綿羊子宮胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠多莉羊的培育過程多莉羊的培育過程融合后的卵細胞融合后的卵細胞克隆動物的研究意義克隆動物的研究意義1. 1.克隆動物作為生物反應器，生產醫用蛋白克隆動物作為生物反應器，生產醫用蛋白2. 2.改良動物品種改良動物品種 3. 3.治療人類疾病，作為供體治療人類疾病，作

14、為供體4. 4.保護瀕危動物保護瀕危動物體細胞核移植技術存在的問題：體細胞核移植技術存在的問題：許多克隆動物表現出遺傳和生理缺陷，許多克隆動物表現出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發育困難，臟如體型過大，異常肥胖，發育困難，臟器缺陷，免疫失調等。器缺陷，免疫失調等。6. 6.世界上第一只克隆綿羊世界上第一只克隆綿羊“多莉多莉”的培育等程序如圖所的培育等程序如圖所示。請仔細看圖后回答問題：示。請仔細看圖后回答問題：黑面綿羊去黑面綿羊去核卵細胞核卵細胞白面綿羊卵白面綿羊卵腺細胞核腺細胞核重組細胞重組細胞早期胚胎早期胚胎另一頭母綿羊子宮另一頭母綿羊子宮克隆綿羊多莉克隆綿羊多莉ab電脈沖處理妊娠

15、、出生寫出寫出 、所指的細胞工程、所指的細胞工程各稱：各稱：。實施細胞工程時，所需的實施細胞工程時，所需的受體細胞大多采用動物卵細胞受體細胞大多采用動物卵細胞的原因是的原因是： 。多莉面部的毛色是多莉面部的毛色是 ，判斷依據：判斷依據： 。繼植物組織培養之后，克隆繼植物組織培養之后，克隆綿羊培育成功，證明動物細胞綿羊培育成功，證明動物細胞也具有也具有 。 請舉例說明克隆綿羊培育成請舉例說明克隆綿羊培育成功的實際意義功的實際意義： 。1 1、科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，、科學家用小鼠骨髓瘤細胞與某種細胞融合，得到雜交細胞，經培養可產生大量的單克隆得到雜交細胞，經培養可產生大量的單克隆抗

16、體，與骨髓疤細胞融合的是（抗體，與骨髓疤細胞融合的是（ ） a.a.經過免疫的經過免疫的b b淋巴細胞淋巴細胞 b.b.沒經過免疫的沒經過免疫的t t淋巴細胞淋巴細胞c.c.經過免疫的經過免疫的t t淋巴細胞淋巴細胞 d.d.沒經過免疫的淋巴細胞沒經過免疫的淋巴細胞a2.動物細胞融合的目的中最重要的是動物細胞融合的目的中最重要的是-（ ）a.克服遠緣雜交不親和克服遠緣雜交不親和 b. 制備單克隆抗體制備單克隆抗體 c.培育新品種培育新品種 d.生產雜種細胞生產雜種細胞3.動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較中，正確的是動物細胞融合與植物體細胞雜交的比較中，正確的是（ ）誘導融合的方法完全相同誘導

17、融合的方法完全相同 b.所用的技術手段基本相同所用的技術手段基本相同 c. 所采用的原理完全相同所采用的原理完全相同 d. 都能形成雜種細胞都能形成雜種細胞 bd4. 單克隆抗體制備過程中培育的雜交細胞是單克隆抗體制備過程中培育的雜交細胞是-（ ）a.由小鼠能產生抗體的由小鼠能產生抗體的b淋巴細胞與肝細胞融合淋巴細胞與肝細胞融合 b.由小鼠一個由小鼠一個b淋巴細胞誘導融合而成淋巴細胞誘導融合而成 c.由小鼠一個由小鼠一個b淋巴細胞與肌瘤細胞誘導融合而成淋巴細胞與肌瘤細胞誘導融合而成 d.由小鼠一個由小鼠一個b淋巴細胞與骨髓瘤細胞誘導融合而成淋巴細胞與骨髓瘤細胞誘導融合而成 d 1 1、在動物細

18、胞培養過程中遺傳物質發生改、在動物細胞培養過程中遺傳物質發生改變的細胞是變的細胞是 - -（ ） a a細胞系細胞系 b b細胞株細胞株 c c原代細胞原代細胞 d d傳代細胞傳代細胞2 2、動物細胞工程技術的基礎是、動物細胞工程技術的基礎是 - -（）（） a.a.動物細胞融合動物細胞融合 b.b.單克隆抗體單克隆抗體 c.c.胚胎移植胚胎移植 d.d.動物細胞培養動物細胞培養ad3 3、用于動物細胞培養的組織和細胞大都取自胚胎、用于動物細胞培養的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞是這樣的組織細胞 （ ） a.a.容易產生各種變異容易產生各種變異 b b具有更強的全能性具有更強的全能性 c.c.取材十分方便取材十分方便 d d分裂增殖的能力強分裂增殖的能力強d 4. 4.動物細胞培養與植物細胞培養的重要區別在于動物細胞培養與植物細胞培養的重要區別在于-（ ） a.a.培養基不同；培養基不同； b.b.動物細胞培養不需要在無菌條件下進行；動物細胞培養不需要在無菌條件下進行； c.c.動物細胞可以傳代培養，而植物細胞不能；動物細胞可以傳代培養，而植物細胞不能； d.d.動物細胞能夠大量培養，而植物細胞只能培動物細胞能夠大量培養，而植物細胞只能