1、str非變性非變性hplc快速診斷快速診斷 唐氏綜合征方法的建立及評價唐氏綜合征方法的建立及評價rapid prenatal diagnosis of down syndrome by non-denaturing high-performance liquid chromatography with short tandem repeat markers概述概述 唐氏綜合征唐氏綜合征(down syndrome，ds) ，又稱，又稱21三體綜合三體綜合征或先天愚型，是人類最常見的染色體數目異常導致的征或先天愚型，是人類最常見的染色體數目異常導致的遺傳性疾病，是先天智力低下的最常見原因。新生兒

2、發遺傳性疾病，是先天智力低下的最常見原因。新生兒發病率約病率約1/800-1/ 600。ds的遺傳分型：的遺傳分型：（1）21三體型三體型(47,xx(xy),+21，占，占92.5%（2）易位型：）易位型： 占占4.8%（3）嵌合型：）嵌合型： 占占2.7%（4）雙重三體，較罕見）雙重三體，較罕見（5）21部分三體部分三體 v新生兒的新生兒的ds發生率約為發生率約為12，我國目前大約有，我國目前大約有60萬以上的萬以上的ds患兒。患兒。v該病目前缺乏有效的治療手段，預防該病目前缺乏有效的治療手段，預防ds患兒出生是防患兒出生是防治該病的主要措施。治該病的主要措施。v因此，建立一種快速、準確、

3、低成本、高通量、自動因此，建立一種快速、準確、低成本、高通量、自動化程度高的唐氏綜合征產前診斷方法對于優生優育具有化程度高的唐氏綜合征產前診斷方法對于優生優育具有重要意義。重要意義。研究背景國內外相關產前診斷方法現狀：國內外相關產前診斷方法現狀：v超聲波篩查：通過超聲波檢查胎兒頸部半透明組織厚度、超聲波篩查：通過超聲波檢查胎兒頸部半透明組織厚度、股骨長度與肱骨長度、心臟異常情況、胎兒鼻骨發育情況、股骨長度與肱骨長度、心臟異常情況、胎兒鼻骨發育情況、孕早期胎兒靜脈導管血流檢測等以達到診斷目的。孕早期胎兒靜脈導管血流檢測等以達到診斷目的。該方法陽該方法陽性率低，假陽性率高，易漏診誤診性率低，假陽性

4、率高，易漏診誤診。v孕早、中期母體血清相關標記物結合孕婦年齡篩查：主要孕早、中期母體血清相關標記物結合孕婦年齡篩查：主要相關血清標記物有相關血漿蛋白相關血清標記物有相關血漿蛋白(ppa)、甲胎蛋白、甲胎蛋白(fp)、游、游離雌三醇離雌三醇(e3)、人絨毛膜促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素(hcg)。檢出率為檢出率為60-70%，假陽性率，假陽性率5%。v羊水細胞培養、染色體羊水細胞培養、染色體g顯帶核型分析：經典方法，但顯帶核型分析：經典方法，但費費時長時長(2-3周周)，手工操作量大，羊水細胞培養成功率低，手工操作量大，羊水細胞培養成功率低。v熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence

5、 in-situ hybridization，fish)：該方法準確率高，但同時該方法準確率高，但同時技術要求高，成本昂貴技術要求高，成本昂貴 。vpcr熒光染料定量分析法：同時擴增熒光染料定量分析法：同時擴增21號染色體的人肝型號染色體的人肝型磷酸果糖激酶基因磷酸果糖激酶基因(pekl2ch21)外顯子外顯子8和和1號染色體的人肌號染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因型磷酸果糖激酶基因(pekm2ch1)外顯子外顯子9，擴增產物經熒，擴增產物經熒光染料標記后，再用凝膠成像系統對光染料標記后，再用凝膠成像系統對pcr產物進行吸光度分產物進行吸光度分析。該方法析。該方法操作較繁瑣，不能實現對大人群的高

6、通量篩查操作較繁瑣，不能實現對大人群的高通量篩查。vpcr擴增短串聯重復序列擴增短串聯重復序列(short tandem repeats，str)后，后，經聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，進行經聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，進行dna密度分析：該方法密度分析：該方法操作繁瑣，費時長，靈敏度低，不能實現高通量篩查操作繁瑣，費時長，靈敏度低，不能實現高通量篩查。vstr熒光定量熒光定量pcr分析方法：通過分析峰面積比值或出峰分析方法：通過分析峰面積比值或出峰個數進行診斷。但該方法個數進行診斷。但該方法成本較高成本較高，僅合成標記探針就需數，僅合成標記探針就需數千元，而且在產前診斷方面千元，而且在產前診斷方面

7、特異性稍差特異性稍差。相對以上技術而言，相對以上技術而言，dhplc技術是一種高通量、快速、技術是一種高通量、快速、準確、靈敏度高、經濟、自動化程度高的遺傳變異篩查準確、靈敏度高、經濟、自動化程度高的遺傳變異篩查技術技術, 在非變性溫度條件下，可以對不同長度的雙鏈在非變性溫度條件下，可以對不同長度的雙鏈dna片段進行分離。片段進行分離。近期大量研究發現，多余的片段中含有近期大量研究發現，多余的片段中含有21q22帶，就會帶，就會患患ds，反之則不會患病。表明，反之則不會患病。表明21q22是是ds的關鍵區域。的關鍵區域。str均勻地分布于人類基因組中，具有高度多態性和高均勻地分布于人類基因組中

8、，具有高度多態性和高雜合度等特點，并遵循孟德爾共顯性遺傳規律。雜合度等特點，并遵循孟德爾共顯性遺傳規律。由此引出對本課題的研究。由此引出對本課題的研究。研究內容 str位點的選取：通過網上資源及實際分析，選取理位點的選取：通過網上資源及實際分析，選取理論及實際雜合度較高的論及實際雜合度較高的str位點。位點。 方法的建立與優化：對所選實際雜合度較高的方法的建立與優化：對所選實際雜合度較高的str位位點進行點進行pcr擴增，利用非變性高效液相色譜技術分離擴增，利用非變性高效液相色譜技術分離pcr產物中不同片段長度的產物中不同片段長度的dna片段，由不同的峰型可片段，由不同的峰型可以診斷以診斷ds

9、患者并鑒定其染色體的親代來源。患者并鑒定其染色體的親代來源。 方法的評價：用細胞培養、染色體方法的評價：用細胞培養、染色體g顯帶核型分析方顯帶核型分析方法同時對所有樣本進行確診，與本課題所建立方法進行法同時對所有樣本進行確診，與本課題所建立方法進行雙盲評價。雙盲評價。技術路線(1) 標本的收集：收集標本的收集：收集20例例ds家系和家系和100例正常人群外周血標本，家系標例正常人群外周血標本，家系標本每份分為兩組，一組進行細胞培養及本每份分為兩組，一組進行細胞培養及g顯帶核型分析，另一組提取顯帶核型分析，另一組提取dna。(2) str位點的選取：利用網上資源選取理論雜合度較高位點的選取：利用

10、網上資源選取理論雜合度較高(0.8)的的str位位點，然后通過對點，然后通過對100例正常人群標本的分析，獲得實際雜合度較高的例正常人群標本的分析，獲得實際雜合度較高的str位點。位點。(3) pcr條件的建立及優化：條件的建立及優化： pcr擴增所選實際雜合度較高的擴增所選實際雜合度較高的str位點。位點。(4) 非變性高效液相色譜技術診斷非變性高效液相色譜技術診斷ds方法的建立：分離不同長度的方法的建立：分離不同長度的pcr擴增產物，優化條件使本方法可以用于擴增產物，優化條件使本方法可以用于ds產前診斷并鑒定患者染色體的產前診斷并鑒定患者染色體的親代來源。親代來源。(5) 評價實驗：用細胞

11、培養、染色體評價實驗：用細胞培養、染色體g顯帶核型分析方法與本課題所建立顯帶核型分析方法與本課題所建立方法進行雙盲評價。方法進行雙盲評價。研究方案（1）首次將）首次將dhplc技術應用于唐氏綜合征產前診斷的研技術應用于唐氏綜合征產前診斷的研究，目前，國內外均未見報導。究，目前，國內外均未見報導。（2）本課題所選取的）本課題所選取的str位點均位于位點均位于21q22帶這一關鍵區帶這一關鍵區域內，且具有高雜合度特點，通過對數個域內，且具有高雜合度特點，通過對數個str位點的同時位點的同時檢測，幾乎可以對所有類型的檢測，幾乎可以對所有類型的ds做出診斷（嵌合型做出診斷（嵌合型ds患者患者體內三體型細胞比例低者除外），可以對體內三體型細胞比例低者除外），可以對99.9%以上的以上的ds患者做出診斷。患者做出診斷。（3）本方法同時具有快速、準確、低成本、高通量等其它）本方法同時具有快速、準確、低成本、高通量等其它方法不具備的優點。方法不具備的優點。特色與創新點已完成了已完成了21例例ds家系標本的采集工作家系標本的采集工作(細胞染色體核型分細胞染色體核型分析確診工作已完成析確診工作已完成) ，并已提取，并已提取dna，正常人群標本，正常人群標本100例例也