1、第二章第二章 植植 物物 組組 織織 培培 養養 基基 本本 技技 術術第一節第一節 實驗室設置及基本技術實驗室設置及基本技術第二節第二節 組織培養所需的環境條件及營養成分組織培養所需的環境條件及營養成分第三節第三節 培養基的配制與滅菌培養基的配制與滅菌第四節第四節 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌第五節第五節 外植體的接種和培養外植體的接種和培養第六節第六節 外植體的褐變及其預防措施外植體的褐變及其預防措施第七節第七節 玻璃化現象及其預防措施玻璃化現象及其預防措施第八節第八節 試管苗的馴化和移栽試管苗的馴化和移栽第一節第一節 實驗室設置及基本技術實驗室設置及基本技術一、實驗室組成一、實驗

2、室組成二、儀器設備二、儀器設備三、培養器皿三、培養器皿及實驗用具及實驗用具四、洗滌技術四、洗滌技術五、滅菌技術五、滅菌技術六、無菌操作六、無菌操作 組織培養實驗室布局的總體要求組織培養實驗室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察一一、實驗室組成基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養室細胞生物學實驗室溫 室生化分析實驗室基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養架培養架培養架培養架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室準備室緩沖室緩沖室無菌室無菌室培養室培養室組織培養準備實驗室緩沖室培養室無菌室（一）無菌室（二）無菌室

3、（二）二、儀器設備1、基本儀器設備136 6912 1358 冰箱、電（磁）爐、酸度計、純水器、天平、移液器、解剖鏡、光照培養箱、搖床、生化培養箱、培養基分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計電爐天平純水器培養基分裝器攪拌器2、滅菌設備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜干熱消毒柜無菌瓶頂過濾裝置無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）3、無菌操作設備、無菌操作設備 超凈工作臺超凈工作臺無菌接種箱無菌接種箱4、細胞培養設備、細胞培養設備 搖 床培養架培養架hzc-250恒溫振蕩培養箱 150c 250d 光照培養箱光照培養

4、箱 5、細胞學鑒定設備、細胞學鑒定設備 光學顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學顯微光學顯微鏡鏡1、玻璃器皿三、培養器皿及實驗用具培養皿三角瓶培養瓶2、金屬材質用具鑷子 解剖刀接種針四、洗滌技術1、玻璃器皿洗滌、玻璃器皿洗滌新購置玻新購置玻璃器皿璃器皿1%稀hcl浸漬浸漬12h洗衣粉洗衣粉洗滌洗滌清水清水沖洗沖洗晾干晾干備用備用已用過的已用過的玻璃器皿玻璃器皿2、塑料用品洗滌、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用新的塑料器皿打開即用已用過的已用過的塑料器皿塑料器皿2%naoh浸泡浸泡12h清水清水沖洗沖洗2%5%鹽鹽酸浸泡酸浸泡30min清水清水沖洗沖洗蒸餾水蒸餾水沖洗沖洗晾干備

5、用晾干備用3、金屬用品洗滌、金屬用品洗滌熱洗衣粉水熱洗衣粉水洗凈洗凈沖洗沖洗擦干擦干五、滅菌技術五、滅菌技術物理方法：物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、過濾物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等除菌等化學方法：化學方法： 消毒劑、抗菌素滅菌消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法、滅菌方法2、滅菌、滅菌（1）培養基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104pa 溫度在121 滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對應的溫度飽和蒸汽壓力與其對應的溫度飽和蒸汽壓力飽和蒸汽壓力溫度（溫度（）飽和蒸汽壓力飽和蒸汽壓力溫度（溫度（）kg/cm

6、21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿滅菌：塑料器皿滅菌： 多采用多采用高壓蒸汽消毒滅菌高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：）金屬用具滅菌：灼燒滅菌灼燒滅菌 浸入浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用卻后

7、使用（5）接種室滅菌）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室接種室超凈工超凈工作臺作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養材料的接種紫外燈照射（6）外植體滅）外植體滅菌菌流水沖洗流水沖洗1020min或更長時間或更長時間70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗45次次在在10%的次氯酸鈉、的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡飽和漂白粉浸泡30min左右左右備用備用常用消毒劑消毒滅菌比較表常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑消毒劑使用濃度使用濃度（%）去除難易去除難易消毒時間消毒時間（min）效果效果次氯酸鈣次氯酸鈣次氯酸鈉次氯酸鈉漂白粉漂白

8、粉溴水溴水過氧化氫過氧化氫升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸銀硝酸銀9102飽和溶液飽和溶液1210120.11707545（mg/l1易易易易易易易易最易最易較難較難易易中中較難較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好較好較好好好六、無菌操作六、無菌操作實驗員消毒實驗員消毒實驗室、無實驗室、無菌臺滅菌菌臺滅菌實驗器材實驗器材的滅菌的滅菌無菌接種無菌接種消消 毒毒實驗臺實驗臺衛生衛生培養室培養室培養培養1、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。種室。2、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外

9、燈，、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射照射40min左右，后關閉。左右，后關閉。3、開啟過濾室風機，使無菌風吹拂工作臺面、開啟過濾室風機，使無菌風吹拂工作臺面和四周的臺壁。和四周的臺壁。4、用、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。的酒精擦拭工作臺和雙手。5、用沾有、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養酒精的紗布擦拭盛培養基的培養器皿，放進工作臺。基的培養器皿，放進工作臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。、在酒精燈火焰附近

10、切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉動瓶口使瓶口各部分都燒到。口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養材料放入培養瓶，蓋上瓶口。、把培養材料放入培養瓶，蓋上瓶口。11、接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。、接種結束后，清理和關閉超凈工作臺。注意：操作期間應經常用注意：操作期間應經常用70%70%75%75%的酒精擦拭工的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應反復在作臺和雙手；接種器械應反復在95%95%的酒精中浸泡的酒精中浸泡和在火焰上消毒。和在火焰上消毒。第二節第二節 植物組織培養所需的環境植物組織

11、培養所需的環境 條件及營養成分條件及營養成分一、環境條件一、環境條件 與自然條件一樣，組織培養中的外植體的生長要受與自然條件一樣，組織培養中的外植體的生長要受到到溫度、光照、濕度溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同等各種物理條件，不同氣體、培養氣體、培養基基的組成、的組成、ph值值和和滲透壓滲透壓等各種化學條件，以及等各種化學條件，以及外植體外植體部位、大小、細胞密度部位、大小、細胞密度等各種生物條件等環境條件的影等各種生物條件等環境條件的影響。如何根據需要來控制培養條件是組織培養中的一個響。如何根據需要來控制培養條件是組織培養中的一個重要問題。重要問題。溫度溫度光照光照濕度濕度氣體氣體滲透壓

12、滲透壓ph值值一般最適溫度在一般最適溫度在252之間之間環境條環境條件件最常用的是最常用的是光照光照16h，黑暗，黑暗8h 一般情況下，培養器內相對濕度應達一般情況下，培養器內相對濕度應達100%，培養室內環境的相對濕度在培養室內環境的相對濕度在70%80% 氧氣氧氣是愈傷組織生長所必需的是愈傷組織生長所必需的 調節滲透壓常常從調節滲透壓常常從糖糖入手入手 培養基的培養基的ph值大多在值大多在5.06.5，5.8二、營養成分二、營養成分 植物體內至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素植物體內至少含有幾十種化學元素，其中大部分元素在植物體內起到一定的生理作用：在植物體內起到一定的生理作用：a a

13、、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質；、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質；b b、構成一些特殊的生理活性物質，參與活躍的新陳代謝；、構成一些特殊的生理活性物質，參與活躍的新陳代謝；c c、元素之間相互協調，以維持離子濃度平衡、膠體穩、元素之間相互協調，以維持離子濃度平衡、膠體穩 定、電荷平衡點等化學方面的作用；定、電荷平衡點等化學方面的作用；d d、發育方面，特定的元素影響植物的形態發生和組織、發育方面，特定的元素影響植物的形態發生和組織、 器官建成。器官建成。arnon和和stout（1939）提出的確定植物必需營養元）提出的確定植物必需營養元素的素的3個標準個標準:阿

14、隆和斯托德阿隆和斯托德 a、缺乏該元素，植物生育發生障礙，不能完成其生活史、缺乏該元素，植物生育發生障礙，不能完成其生活史;b、缺乏該元素，就表現為專一的病癥，且這種缺素癥可以、缺乏該元素，就表現為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充該元素來預防和恢復用補充該元素來預防和恢復;c、該元素在植物營養生理上表現直接的效果，而不是由于、該元素在植物營養生理上表現直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學、微生物條件的改進而產生的間接效果。土壤的物理、化學、微生物條件的改進而產生的間接效果。 國內外公認的高等植物所必需的營養元素有國內外公認的高等植物所必需的營養元素有16（17）種：）種： c、h、o、n、

15、p、k、ca、mg、s、fe、b、mn、cu、zn、mo、cl、（、（ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。同時期、不同條件下含量也不同。根據植物體內含量多少，可把這些元素分為根據植物體內含量多少，可把這些元素分為大量營養元素：占干物質重量的大量營養元素：占干物質重量的0.1%以上；以上； c、h、o、n、p、k、ca、mg、s等等9種種微量營養元素：占干物質重量的微量營養元素：占干物質重量的0.1%以下以下 有的只含有的只含0.1mg/kg fe、b、mn、cu、zn、mo、cl等等7種種按照國際植物生理協會的建議：

16、按照國際植物生理協會的建議： 所需濃度所需濃度 0.5mmol/l 0.5mmol/l的元素為大量元素的元素為大量元素 所需濃度所需濃度 0.5mmol/l 0.5mmol/l的元素為微量元素的元素為微量元素1、大量元素、大量元素n n是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。占有重要的位置。 p p是磷脂的主要成分。培養基中常用是磷脂的主要成分。培養基中常用khkh2 2popo4 4 nahnah2 2popo4 4等。等。 k k對碳水化合物合成，轉移，以及氮

17、素代謝等對碳水化合物合成，轉移，以及氮素代謝等有密切關系。有密切關系。mgmg、s s、caca是葉綠素的組成成分，又是激酶的是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結構具有穩定作用；活化劑，對核蛋白體結構具有穩定作用；s s是含是含s s氨基酸的蛋白質的組成成分。氨基酸的蛋白質的組成成分。caca是構成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩定質是構成細胞壁的成分，對細胞分裂，穩定質膜結構有顯著作用，此外，膜結構有顯著作用，此外，caca及鈣調素在細胞及鈣調素在細胞信號轉導中起重要作用。信號轉導中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中，鐵鐵的使用最大：的使用最大： 一些氧

18、化酶的組成成分一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（使用乙二胺四乙酸鐵（edta-feedta-fe）鰲合）鰲合物防止鐵的沉淀物防止鐵的沉淀 硼硼與蛋白質合成、糖類運輸有著密切的關系與蛋白質合成、糖類運輸有著密切的關系 銅銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長長 錳錳參與植物的光合、呼吸代謝參與植物的光合、呼吸代謝 鉬鉬參與氮素的代謝參與氮素的代謝 氯氯是光合作用水光解的活化劑是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激酶的輔助因子或激活劑活劑參與代謝的調節參與

19、代謝的調節。 缺鐵癥狀缺鐵癥狀：葉面呈綠色網紋狀失綠。隨病勢發展，：葉面呈綠色網紋狀失綠。隨病勢發展，葉片失綠程度加重，出現整葉變為白色，葉緣枯焦，葉片失綠程度加重，出現整葉變為白色，葉緣枯焦，引起落葉。嚴重缺鐵時，新梢頂端枯死。引起落葉。嚴重缺鐵時，新梢頂端枯死。 桃樹桃樹缺銅癥狀：缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現褐色斑點至變黃，葉片出現褐色斑點至擴大變成深褐色，引起落葉。擴大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的的芽開始生長，形成叢生的細枝。細枝。 菊花菊花缺錳癥狀：缺錳癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉

20、脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間葉脈仍保持綠色，脈間出現壞死斑，缺素癥狀出現壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。由幼葉開始。 菜豆菜豆梨缺錳癥梨缺錳癥缺鉬癥狀：缺鉬癥狀：葉較小，葉脈間失綠葉較小，葉脈間失綠,有有壞死斑點，且葉邊緣焦壞死斑點，且葉邊緣焦枯，向內卷曲。枯，向內卷曲。十字花科植物缺鉬時葉十字花科植物缺鉬時葉片卷曲畸形，老葉變厚片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。且枯焦。 白菜白菜缺硼癥狀：缺硼癥狀： 受精不良，籽粒減受精不良，籽粒減少少 ，“花而不實花而不實”， “蕾而不花蕾而不花”； 根尖、莖尖的生長點根尖、莖尖的生長點停止生長，而形成簇生停止生長，而形成簇生狀；狀； 常引起各種腐爛病。常引

21、起各種腐爛病。 馬鈴薯馬鈴薯缺鋅癥狀：缺鋅癥狀： 小葉病，葉片變小葉病，葉片變小，兩節之間小，兩節之間縮短。葉脈間縮短。葉脈間失去綠色或者失去綠色或者變白。變白。植物缺素癥植物缺素癥缺氮：首先表現在老葉上均一的缺綠現象；缺氮：首先表現在老葉上均一的缺綠現象；缺磷：老葉片發藍稍帶紫色，葉緣變為紫紅色，葉尖枯死；缺磷：老葉片發藍稍帶紫色，葉緣變為紫紅色，葉尖枯死；缺鉀：先表現在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，卷曲皺縮，莖的缺鉀：先表現在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，卷曲皺縮，莖的節間變短；節間變短；缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；缺硫：首先表現為新葉葉片缺綠或發紫

22、；缺硫：首先表現為新葉葉片缺綠或發紫；缺錳缺錳：新葉脈間失綠；：新葉脈間失綠；缺鐵缺鐵：葉片黃，葉脈綠；：葉片黃，葉脈綠；缺硼缺硼：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；缺鋅缺鋅：老葉脈間缺綠，出現白色壞死斑；：老葉脈間缺綠，出現白色壞死斑；缺銅缺銅：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴重整葉萎蔫過早脫落；：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴重整葉萎蔫過早脫落；缺鉬缺鉬：不能形成花器或花早落。：不能形成花器或花早落。 3、碳源、碳源 碳源物質包括糖類物質、醇類物質和有機碳源物質包括糖類物質、醇類物質和有機酸，以酸，以糖類糖類物質最重要。物質最重要。 糖類物

23、質特點：糖類物質特點： 具有遇熱易變具有遇熱易變 利于吸收和利用利于吸收和利用 使用濃度一般在使用濃度一般在2%-5%2%-5% 提供能源和調節滲透壓提供能源和調節滲透壓 4、維生素類、維生素類 以各種以各種輔酶輔酶的形式存在的形式存在 參與多種代謝活動參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進作用對生長，分化等有很好的促進作用 主要分為主要分為脂溶性維生素脂溶性維生素和和水溶性維生素水溶性維生素 常用維生素有常用維生素有v vb1b1和和v vb6b6 5、肌醇、肌醇 環己六醇環己六醇 細胞壁的構建材料細胞壁的構建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡

24、等生理活動生理活動 促進活性物質發揮作用促進活性物質發揮作用6、氨基酸、氨基酸 蛋白質的組成成分蛋白質的組成成分 有機氮源有機氮源 可直接被細胞吸收利用可直接被細胞吸收利用 培養基中常用的是培養基中常用的是甘氨酸甘氨酸7、天然復合物、天然復合物 促進某些愈傷組織和器官的生長促進某些愈傷組織和器官的生長 化學成分不明、復雜化學成分不明、復雜 天然營養混合物天然營養混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、瓊脂、瓊脂 是使用最普遍的凝固劑是使用最普遍的凝固劑用量一般在用量一般在6-10g/l6-10g/l之間之間顏色以淺、透明度高的好，潔凈為上品顏色以淺、透

25、明度高的好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養中還可以使除了瓊脂外，在組織培養中還可以使用卡拉膠、瓊脂糖、結冷膠等。用卡拉膠、瓊脂糖、結冷膠等。9、活性炭、活性炭 吸附培養基及培養物吸附培養基及培養物分泌物中的抑制物質分泌物中的抑制物質 抑制外植體褐變抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產生防止玻璃苗的產生 促進培養物生長和分促進培養物生長和分化化 促進生根促進生根10、抗生素、抗生素 防止外植體內生菌造防止外植體內生菌造成的污染成的污染活性炭活性炭1111、生長素類、生長素類 促進細胞伸長和分裂促進細胞伸長和分裂 促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠

26、、頂端優勢、單性結實頂端優勢、單性結實 誘導愈傷組織形成誘導愈傷組織形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/l0.1mol/l的的naohnaoh中，后者的溶解效中，后者的溶解效果更好果更好 常用的生長素：常用的生長素： iaa(iaa(吲哆乙酸吲哆乙酸) ) naa ( naa (奈乙酸奈乙酸 ) ) 2,4-d( 2,4-d(二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸) ) iba( iba(吲哆丁酸吲哆丁酸) )1212、細胞分裂素類、細胞分裂素類 促進細胞分裂和分化促進細胞分裂和分化 誘導胚狀體和不定芽的形成誘導胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強蛋白質的合成延緩組織的衰老并增強蛋白質

27、的合成 用于離體成花的調控用于離體成花的調控 溶于溶于0.5-1.0mol/l0.5-1.0mol/l的鹽酸或稀薄的的鹽酸或稀薄的naohnaoh中中 常用的細胞分裂素：常用的細胞分裂素： kt (kt (激動素激動素) ) ba(6- ba(6-卞基腺嘌呤卞基腺嘌呤) ) 2-ip( 2-ip(異戊烯氨基嘌呤異戊烯氨基嘌呤) )玉米素玉米素13、赤霉素類和脫落酸、赤霉素類和脫落酸 a、赤霉素類、赤霉素類 組織培養中不常使用組織培養中不常使用 加速細胞的伸長生長加速細胞的伸長生長 促進細胞的分裂促進細胞的分裂 主要是主要是gaga3 3 b b、 抑制細胞分裂和伸長抑制細胞分裂和伸長 促進脫落

28、和衰老促進脫落和衰老 促進休眠和提高抗逆能力促進休眠和提高抗逆能力培養基形態不同：固體培養基、液體培養基培養基形態不同：固體培養基、液體培養基培養過程不同：初代培養基、繼代培養基培養過程不同：初代培養基、繼代培養基其作用不同：誘導培養基、增殖培養基、生根培養基其作用不同：誘導培養基、增殖培養基、生根培養基 營養水平不同：基本培養基、完全培養基營養水平不同：基本培養基、完全培養基一、培養基的種類一、培養基的種類第三節第三節 培養基的配制、滅菌與保存培養基的配制、滅菌與保存1 1、msms培養基培養基 無機鹽濃度高無機鹽濃度高 高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數量

29、的銨鹽含有一定數量的銨鹽 營養豐富營養豐富 不需要添加更多的有機附加物不需要添加更多的有機附加物二、幾種常見培養基的特點二、幾種常見培養基的特點2 2、whitewhite培養基培養基 19431943年由年由whitewhite為培養番茄根尖而設計為培養番茄根尖而設計 1963 1963年作了改良，提高年作了改良，提高mgsomgso4 4的濃度和增加硼元素的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低無機鹽濃度較低 使用廣泛使用廣泛 在生根培養、胚胎培養中有良好的效果在生根培養、胚胎培養中有良好的效果大量元素大量元素含量含量微量元素微量元素含含量量鐵鹽鐵鹽含量含量有機物有機物含含量量其他其他含量含量k

30、no380h3bo31.5fe2(so4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000ca(no3)2 4h2o300mnso4 4h2o7.0煙酸煙酸0.3瓊脂瓊脂8000mgso4 7h2o720znso4 7h2o3.0鹽酸硫胺鹽酸硫胺素素0.1nah2po4 4h2o16.5moo30.0001鹽酸吡哆鹽酸吡哆辛辛0.1kcl65cuso4 5h2o0.001甘氨酸甘氨酸3na2so4200附表：white培養基3 3、b5b5培養基培養基 19681968年由年由gamborggamborg等為培養大豆根細胞而設計等為培養大豆根細胞而設計 含有較低的銨鹽含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸

31、硫胺素較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分 數量(mg/l）組成成分 數量(mg/l) kno3 2500 feso47h2o27.8 cacl22h2o 150 cuso45h2o 0.025 mgso47h2o 250 蔗糖40 (nh4)2so4 134 ph 5.5ki 0.75 肌醇100 h3bo4 3.0 煙酸 1.0 mnso44h2o 10 鹽酸吡哆醇 1.0 znso47h2o 2.0 激動素 0.1 na2moo42h2o0.25 2,4d 0.11.0 cocl26h2o0.025 鹽酸硫銨素 10 na2-edta37.3 b5培養基的組成和配方4 4、n6n6培養基培養

32、基 19741974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養設計年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養設計 kno3 kno3和（和（nh4nh4）so4so4含量高，不含鉬含量高，不含鉬組成成分 數量(mg/l) 組成成分(mg/l) kno3 2.3 na2edta 37.3 cacl22h2o 166 feso47h2o 27.8 mgso47h2o 185蔗糖 50 kh2po4 400 ph 5.8 (nh4)2so4 463 煙酸 0.5 ki 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 h3bo3 1.6 甘氨酸 2.0 mnso44h2o 4.4 鹽酸硫銨 1.0 znso47h2o 1.5n6培養

33、基組成及配方配制培養基應做好幾點工作：配制培養基應做好幾點工作：1 1、實驗用具的準備。包括配制過程中所需電爐、實驗用具的準備。包括配制過程中所需電爐、酸度計、高壓滅菌鍋等設備及其他玻璃器皿的酸度計、高壓滅菌鍋等設備及其他玻璃器皿的清洗和準備清洗和準備. .2 2、試劑、藥品的準備、試劑、藥品的準備3 3、根據培養基的配方、母液擴大倍數及需要配、根據培養基的配方、母液擴大倍數及需要配制的培養基體積計算所需各種母液及其他附加制的培養基體積計算所需各種母液及其他附加物的量物的量三、培養基的配制具體操作如下：具體操作如下：1 1、取規定數量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷、取規定數量的糖源和凝固劑置于燒

34、杯或搪瓷鍋內，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；鍋內，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2 2、根據計算所需量依次加入大量元素、微量元、根據計算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機物、生長調節物質素、鐵鹽、有機物、生長調節物質母液母液及其他特及其他特殊的附加物，攪拌均勻；殊的附加物，攪拌均勻；3 3、加水、加水定容定容至規定體積，攪拌均勻；至規定體積，攪拌均勻；4 4、調整培養基的、調整培養基的phph值；值；5 5、分裝（倒）；、分裝（倒）；6 6、封口（擰蓋）。、封口（擰蓋）。 組織培養必須在無菌環境中進行，因組織培養必須在無菌環境中進行，因此培養基的滅菌操作非常重要。此培養基的滅

35、菌操作非常重要。 培養基分裝封口后立刻進行滅菌，至培養基分裝封口后立刻進行滅菌，至少在少在24h24h內完成滅菌程序。內完成滅菌程序。 一般采用的是一般采用的是高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌。四、培養基的滅菌四、培養基的滅菌 滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸滅菌鍋有很多種，實驗室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點：汽滅菌鍋，使用時要注意一下幾點：1、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；、鍋中應放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空、裝鍋時不要過度傾斜，可保持內部有一定的空 間，利于蒸汽流動；間，利于蒸汽流動；3、增壓前高壓鍋內的空氣必須排

36、凈，否則易影響、增壓前高壓鍋內的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；滅菌效果；4、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵、滅菌過程中，應盡量保持壓力恒定，嚴格遵守滅菌時間；守滅菌時間；5、排氣降壓時應緩慢進行；、排氣降壓時應緩慢進行；6、只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才、只有待高壓鍋內壓力表指針恢復到零后，才能開啟壓力鍋；能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時，應有專人看守。、高壓鍋工作時，應有專人看守。高壓滅菌的原理在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在內溫度也

37、隨之增加。在0.1mpa的壓力下，的壓力下，鍋內溫度達鍋內溫度達121。在此蒸汽溫度下，可以。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。 注意事項注意事項 完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05mpa時，打開放氣閥，放出空氣

38、，待壓力表指針時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓歸零后，再關閉放氣閥。關閥再通電后，壓力表上升達到力表上升達到0.1mpa時時,開始計時，維持壓力開始計時，維持壓力0.10.15mpa 20分鐘。分鐘。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每三是濕熱的

39、蒸汽有潛熱存在，每1克水在克水在100時，由氣態變時，由氣態變為液態時可放出為液態時可放出226kj（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。 在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。溫度低于飽和蒸汽的

40、溫度。 如果壓力未降到如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。 滅菌后的培養基經冷卻和凝固后即可使用檢滅菌后的培養基經冷卻和凝固后即可使用檢驗滅菌效果。驗滅菌效果。 檢驗方法：檢驗方法： 將培養基置于培養室中將培養基置于培養室中3 3天，若沒有污染現象，天，若沒有污染現象，說明滅菌可靠，可以使用。說明滅菌可靠，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時要進行防保存在低溫

41、條件下。常溫下保存時要進行防塵和避光處理。塵和避光處理。 保存時間不可過長。保存時間不可過長。五、培養基的保存五、培養基的保存第四節第四節 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌 一、一、 外植體的選擇外植體的選擇 二、二、 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 三、三、 污染原因和預防措施污染原因和預防措施 一、外植體的選擇一、外植體的選擇 植物組織培養的主要過程大致包括：植物組織培養的主要過程大致包括：外植體的外植體的選擇選擇、培養基的制備、器具的消毒、無菌操作和環、培養基的制備、器具的消毒、無菌操作和環境條件的調控。境條件的調控。 1 1、選擇優良的種質、選擇優良的種質 無論是離體培養繁殖種苗

42、，或者是進行生物無論是離體培養繁殖種苗，或者是進行生物技術研究，培養材料的選擇都要從主要的植物入手技術研究，培養材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優良的種質，選取性狀優良的種質，或或特殊的基因型特殊的基因型。對材料。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成功機率，增加其實用價值。成功機率，增加其實用價值。 2 2、選擇健壯的植株、選擇健壯的植株 組織培養用的材料，最好從生長健壯的無病蟲組織培養用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，的植株上，選取發育正常的器官或組織選取發育正常的器官或組織。因為這些。因為這些器官或組織代謝旺盛，再

43、生能力強，比較容易培養器官或組織代謝旺盛，再生能力強，比較容易培養成功。成功。3 3、選擇最適的時期、選擇最適的時期 組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節和植物的生長發育階段。如快速繁殖時應在植株生和植物的生長發育階段。如快速繁殖時應在植株生長的最適時期取材，這樣不僅成活率高，而且生長長的最適時期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高速度快，增殖率高。4 4、選取適宜的大小、選取適宜的大小 建立無菌材料時，取材的大小根據不同植建立無菌材料時，取材的大小根據不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材

44、料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養材料的大小，在般選取培養材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如。如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。二、外植體的滅菌方法二、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果2、外植體的滅菌方法、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑次氯酸鈣次氯酸鈣次氯酸鈉次氯酸鈉漂漂 白白 粉粉氯氯 化化 汞汞酒酒 精精過氧化氫過氧化氫使用濃度（使用濃度（% %）9 910102 2飽和

45、濃度飽和濃度0.10.11 17070757510101212清除的難易清除的難易易易易易易易較難較難易易最易最易消毒時間消毒時間5 530305 530305 530302 210100.20.22 25 51515效效 果果很好很好很好很好很好很好最好最好好好好好2、外植體的滅菌方法、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進行先要進行預處理預處理。植物材料一般采取的預處理。植物材料一般采取的預處理方法是：方法是：先對植物組織進行修整，去掉不需要先對植物組織進行修整，去掉不需要的部分，將準備使用的植物材料在流水中沖洗的部分，將準備使用的

46、植物材料在流水中沖洗干凈。經過預處理的植物材料，其表面仍有很干凈。經過預處理的植物材料，其表面仍有很多多細菌細菌和和真菌真菌，因此還需進一步滅菌。，因此還需進一步滅菌。 常規的表面滅菌處理方法常規的表面滅菌處理方法把材料放進把材料放進70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（hgcl2）浸泡）浸泡5 10min 。 或用或用10%的的次氯酸鈉溶液次氯酸鈉溶液浸浸泡泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗無菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。在滅菌劑里滴入數滴在滅菌劑里滴入數滴0.1%的的twee

47、n20（吐溫）（吐溫） 或或tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。濕潤劑，則滅菌效果更好。 三、污染原因和預防措施三、污染原因和預防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養過程中培養基和培養材是指在組織培養過程中培養基和培養材料滋生雜菌，導致培養失敗的現象。料滋生雜菌，導致培養失敗的現象。污染的原因：污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細菌及從病原菌方面來分析主要有細菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養基及器皿滅菌不徹底、操作人員植體帶菌、培養基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規程等引起的。未遵守操作規程等引起的

48、。細菌污染的特點細菌污染的特點：是在材料附近的培養基中出是在材料附近的培養基中出現渾濁和云霧狀痕跡。現渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后一般在接種后12天即可天即可發現。發現。原因：材料帶菌；原因：材料帶菌； 培養基滅菌不徹底；培養基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規程。操作人員未遵守操作規程。因此接種人員的手應經常用因此接種人員的手應經常用70%酒精擦洗，鑷子、酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。真菌污染的特點真菌污染的特點：培養瓶內往往會出現白、黑培養瓶內往往會出現白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后在接種后310天

49、才能發天才能發現。現。原因：周圍環境不清潔；原因：周圍環境不清潔； 超凈工作臺的過濾裝置失效；超凈工作臺的過濾裝置失效； 培養瓶等器皿的口徑過大。培養瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作為了減少損失，提高工作效率，必須在每個操作環節注意防止污染的發生。環節注意防止污染的發生。 2 2、污染的預防措施、污染的預防措施發現污染的材料應及時處理，否則將導致發現污染的材料應及時處理，否則將導致培養室環境污染。培養室環境污染。對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進行更為嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培養行更為嚴格的滅菌，然后接入新鮮的培養基中重新培

50、養。基中重新培養。要處理的污染培養瓶最好在打開瓶蓋前，要處理的污染培養瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然先集中進行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。后洗凈備用。現就根據污染途徑，闡述污染的幾個預防措現就根據污染途徑，闡述污染的幾個預防措施施:1）防止材料帶菌的措施防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對）用莖尖作外植體時，可在室內或無菌條件下對 枝條先進行預培養。枝條先進行預培養。u枝條枝條 水洗凈水洗凈 插入無糖的營養液或自來水插入無糖的營養液或自來水 抽枝抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少

51、材料的污染。接種。這樣便可大大減少材料的污染。u在無菌條件下對采自田間的枝條進行暗培養，待在無菌條件下對采自田間的枝條進行暗培養，待 抽出徒長的黃化枝條時采枝，經滅菌后接種也可明抽出徒長的黃化枝條時采枝，經滅菌后接種也可明 顯減少污染。顯減少污染。 （2）選擇合適的時間去田間采取外植體）選擇合適的時間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要在晴天采取外植體時，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經過日曬后可殺比早晨采的污染少，因材料經過日曬后可殺死部分細菌或真菌死部分細菌或真菌。 但目前對材料內部污染還沒有令人滿意的但

52、目前對材料內部污染還沒有令人滿意的滅菌方法滅菌方法。在菌類長入組織內部時，不但。在菌類長入組織內部時，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內部的分生組織，以收到一定織，只接種內部的分生組織，以收到一定的防污染效果。的防污染效果。2）外植體的滅菌）外植體的滅菌（1 1）多次滅菌法：）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）；休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入其次，將切好的外植體放入1.3%1.3%的次氯酸鹽溶的次氯酸鹽溶液中，滅菌液中，滅菌30min30min； 第三，在

53、無菌蒸餾水中沖洗第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-53-5次；次； 第四，將材料封閉在無菌的培養皿中過夜，保第四，將材料封閉在無菌的培養皿中過夜，保持一定溫度；持一定溫度； 第五，次日將葉片用第五，次日將葉片用2.6%2.6%次氯酸鈉滅菌次氯酸鈉滅菌30min30min，然后用蒸餾水洗，然后用蒸餾水洗3-53-5次。次。（2）多種藥液交替浸泡法）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：對容易污染而難滅菌的材料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修

54、剪掉外植體上無用的部分，剝去芽上鱗片；部分，剝去芽上鱗片；第第2，將材料放入，將材料放入70%酒精中滅菌數秒鐘；酒精中滅菌數秒鐘；第第3，在，在1：500roccal b（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min；第第4，放入，放入5%10%次氯酸鈉溶液中并滴入次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫吐溫80”數滴，數滴，滅菌滅菌1530min，或浸入，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并加入升汞溶液中并加入“吐溫吐溫80”數滴，滅菌數滴，滅菌510min；第第5，用無菌水沖洗，用無菌水沖洗5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的再放入無菌的0.

55、1m鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數次。鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數次。 3）玻璃器皿的滅菌）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時蒸汽滅菌鍋中進行高溫高壓滅菌，滅菌時間可延長達間可延長達25min30min。干熱滅菌法干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進行滅菌。箱中進行滅菌。煮沸滅菌煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸即將玻璃器皿放入水中煮沸進行滅菌。進行滅菌。4 4）金屬器械的滅菌）金屬器械的滅菌 火焰滅菌法：火焰滅菌法：即把金屬器械放在即把金屬器械放在95%的酒的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃

56、燒滅菌。精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。這一步驟應當在無菌操作過程中反復進行。干熱滅菌法：干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內，放在烘箱器械用紙包好，盛在金屬盒內，放在烘箱中滅菌。中滅菌。濕熱滅菌法：濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等工作服、口罩、帽子等布質品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾布質品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質品，放入高壓鍋中，干的的布質品，放入高壓鍋中，121 c的溫度，滅菌的溫度，滅菌20 min30min。5）布質制品的滅菌）布質制品的滅菌 6）無菌操作室的滅菌）無菌操作室的滅菌 無

57、菌操作室的地面、墻壁和工作臺的無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用滅菌可用2%的新潔爾滅或的新潔爾滅或70%的酒精擦的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約洗，然后用紫外燈照射約20-30min。使。使用前用用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。錳酸鉀熏蒸。7 7）操作人員在接種時一定）操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的程要嚴格按照無菌操作的程序進行序進行在接種前要在接種前要剪除指甲剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，溶液洗手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡最好再在新潔爾滅溶液中

58、浸泡10min，后用，后用70%的酒精擦手，并用的酒精擦手，并用70%的的酒精擦拭酒精擦拭母種瓶表面母種瓶表面進行消毒，以防把微進行消毒，以防把微生物帶進超凈工作臺。生物帶進超凈工作臺。工作人員在接種時，工作人員在接種時，最好不要感冒咳嗽和最好不要感冒咳嗽和說話說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、。操作人員操作動作要熟練、動作快、規范，這樣可以縮短操作時間，減少污染規范，這樣可以縮短操作時間，減少污染。如脫毒培養抽取莖尖很小，操作時間長了如脫毒培養抽取莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。 小小 結結第一節第一節 外植體的選擇外植體的選

59、擇 ：優良種質、健壯植株：優良種質、健壯植株 、最適的、最適的時期、適宜的大小。時期、適宜的大小。 第二節第二節 外植體的滅菌方法：外植體的滅菌方法：9種常用滅菌藥劑的使用及種常用滅菌藥劑的使用及其效果其效果 、外植體的滅菌方法。、外植體的滅菌方法。第三節第三節 污染原因和預防措施：污染的原因、污染的預污染原因和預防措施：污染的原因、污染的預防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質制品的滅菌、無菌操作室的滅屬器械的滅菌、布質制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時一定要嚴格按照無菌操作的菌、操作人員在接種時一定要嚴格按照無

60、菌操作的程序進行）。程序進行）。 第五節第五節 外植體的接種和培養外植體的接種和培養 一、一、 外植體的接種外植體的接種 二、二、 培養條件培養條件 一、外植體的接種一、外植體的接種 外植體的接種外植體的接種是把經過表面滅菌后的植物是把經過表面滅菌后的植物材料在無菌環境中切割或分離出器官、組織、細胞材料在無菌環境中切割或分離出器官、組織、細胞并轉入到無菌培養基上的全部操作過程。并轉入到無菌培養基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應特別注意