1、第四章 發酵機制本章的教學內容v第一節 糖嫌氣性發酵產物發酵機制v第二節 檸檬酸發酵機制v第三節 氨基酸發酵機制v第四節 抗生素發酵機制第一節 糖嫌氣性發酵產物發酵機制糖酵解糖酵解（glycolysis)glycolysis)是指葡萄糖是指葡萄糖經經empemp途徑途徑生成丙酮酸后，生成丙酮酸后，在無氧條件下在無氧條件下繼續降解繼續降解并釋并釋放出能量的過程放出能量的過程。 nadhnadh2 2在此過程中將氫交給不同的有機物，在此過程中將氫交給不同的有機物，形成各種不同的代謝產物。形成各種不同的代謝產物。糖酵解途徑的特點v糖酵解途徑廣泛存在于各種細胞內，它的任何一個反應均不需要氧；v糖酵解可

2、以分為兩個階段：準備階段（由葡萄糖生成3-磷酸甘油醛）；第二階段（由3碳糖生成丙酮酸）。v催化糖酵解反應的酶主要有激酶、變位酶、異構酶和脫氫酶；v其它糖類作為碳源須先轉化成葡萄糖或其中間代謝產物才能利用；v不同機體和不同代謝條件下，丙酮酸代謝去路不同。1 1、酒精發酵機制、酒精發酵機制由葡萄糖生成乙醇的總反應式由葡萄糖生成乙醇的總反應式: :理論轉化率理論轉化率: : 巴斯德效應巴斯德效應a a、定義、定義: : 在好氣條件下在好氣條件下, ,酵母發酵能力降低酵母發酵能力降低( (或乙醇的或乙醇的 積累減少積累減少, ,或細胞內糖代謝降低或細胞內糖代謝降低) )的現象。的現象。b b、機制、機

3、制: emp: emp途徑中磷酸果糖激酶在有氧時受途徑中磷酸果糖激酶在有氧時受tcatca循環循環 中間代謝產物的反饋調節。中間代謝產物的反饋調節。 (1). (1). 磷酸果糖激酶為變構酶磷酸果糖激酶為變構酶, , 抑制劑：抑制劑：atpatp、檸檬酸和、檸檬酸和 其它高能化合物其它高能化合物; ;激活劑激活劑: amp: amp和和adpadp。 (2). (2). 好氣條件下好氣條件下, ,進入進入tcatca循環循環, ,產生的高檸檬酸量反產生的高檸檬酸量反 饋阻礙酶的合成饋阻礙酶的合成, ,大量的大量的atpatp反饋抑制酶的活性。反饋抑制酶的活性。 (3). 6-(3). 6-磷酸

4、果糖積累對磷酸果糖積累對empemp途徑進行抑制途徑進行抑制, ,導致葡萄糖導致葡萄糖 利用降低。利用降低。酒精發酵中副產物的生成酒精發酵中副產物的生成(1).(1).雜醇油雜醇油 a.a.定義定義: : 碳原子數大于碳原子數大于2 2的脂肪族醇類的統稱。的脂肪族醇類的統稱。 b.b.組成：正丙醇、異丁醇、異戊醇和活性戊醇等。組成：正丙醇、異丁醇、異戊醇和活性戊醇等。 c.c.形成途徑形成途徑: : 氨基酸氧化脫氨作用氨基酸氧化脫氨作用; ;葡萄糖直接生成。葡萄糖直接生成。 (2).(2).甲醇甲醇 果膠（聚半乳糖醛酸甲酯）中甲氧基被水解生成。果膠（聚半乳糖醛酸甲酯）中甲氧基被水解生成。(3)

5、.(3).酯類酯類 發酵過程產生的醇類和酸類經酯化生成。發酵過程產生的醇類和酸類經酯化生成。2 2、乳酸發酵機制、乳酸發酵機制 同型乳酸發酵同型乳酸發酵總反應式為總反應式為: : 理論轉化率理論轉化率: :異型乳酸發酵異型乳酸發酵a. 6-a. 6-磷酸葡萄糖酸途徑磷酸葡萄糖酸途徑總反應式為總反應式為 : : c c6 6h h1212o o6 6chch3 3chohcooh+chchohcooh+ch3 3chch2 2ohoh理論轉化率理論轉化率: : (90/180)(90/180)100% =50%100% =50%b. b. 雙歧途徑雙歧途徑總反應式為總反應式為 : : 2c 2c

6、6 6h h1212o o6 62ch2ch3 3chohcooh+3chchohcooh+3ch3 3coohcooh理論轉化率理論轉化率: : (2 (290)/(290)/(2180)180)100% = 50%100% = 50%3 3 、甘油發酵機制、甘油發酵機制a. a. 亞硫酸鹽法甘油發酵（酵母第二型發酵）亞硫酸鹽法甘油發酵（酵母第二型發酵）b. b. 堿法甘油發酵堿法甘油發酵( (酵母第三型發酵酵母第三型發酵) )第二節 檸檬酸發酵機制檸檬酸發酵屬于好氧發酵，其發酵機制是在了解了三羧酸循環的基礎上才逐漸弄清楚的。1.1.檸檬酸生物合成途徑檸檬酸生物合成途徑葡萄糖生成檸檬酸的總反

7、應式為葡萄糖生成檸檬酸的總反應式為: : 2c 2c6 6h h1212o o6 6+3o+3o2 2 2c 2c6 6h h8 8o o7 7+4h+4h2 2o o 理論轉化率為理論轉化率為106.7%106.7%2. 2. 檸檬酸生物合成的代謝調節檸檬酸生物合成的代謝調節(1).(1).糖酵解及丙酮酸代謝的調節糖酵解及丙酮酸代謝的調節 磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶(pfk)(pfk)是調節酶是調節酶, ,檸檬酸和檸檬酸和atpatp對該酶對該酶抑制抑制, amp , amp 、pipi和和nhnh4 4+ +對酶激活對酶激活; ; nh nh4 4+ +在細胞內濃度升高在細胞內濃度升高, ,

8、解除胞內積累的大量檸檬酸解除胞內積累的大量檸檬酸對酶的抑制對酶的抑制; ; 檸檬酸合成有關酶的調節性質檸檬酸合成有關酶的調節性質 酶酶 激活劑激活劑 抑制劑抑制劑磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶nhnh4 4+ +、ampamp、pipi檸檬酸、檸檬酸、peppep、atp(atp(濃度較濃度較高時高時) )丙酮酸激酶丙酮酸激酶nhnh4 4+ +、k k+ +丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶k k+ +天冬氨酸、 pipi檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶nhnh4 4+ +、k k+ +coacoa、atp-mgatp-mg異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶檸檬酸、檸檬酸、nadphnadph、 - -酮戊酮戊二酸二酸琥

9、珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶草酰乙酸結論結論: : mn mn2+2+缺乏使蛋白質和核酸合成受阻缺乏使蛋白質和核酸合成受阻, ,導致細導致細胞內胞內nhnh4 4+ +水平升高而減少檸檬酸對水平升高而減少檸檬酸對pfkpfk的抑制，的抑制，促進了促進了empemp途徑的暢通。途徑的暢通。(2).co(2).co2 2固定化反應固定化反應 丙酮酸丙酮酸+co+co2 2 +atp +atp 丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶 草酰乙酸草酰乙酸+adp+pi +adp+pi 磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸+co+co2 2 +adp+pi +adp+pi 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 草酰乙酸草酰乙

10、酸+ + atp atp 結論結論1:1: 在組成型的丙酮酸羧化酶作用下在組成型的丙酮酸羧化酶作用下, ,丙酮酸固定化丙酮酸固定化coco2 2生生成草酰乙酸成草酰乙酸, ,保證檸檬酸的積累。保證檸檬酸的積累。 結論結論2:2: 丙酮酸氧化脫羧生成乙酰丙酮酸氧化脫羧生成乙酰coa ,coa ,和和coco2 2 固定兩個反應固定兩個反應平衡平衡, ,保持了檸檬酸合成能力保持了檸檬酸合成能力。 (3).(3).三羧酸循環的調節三羧酸循環的調節 結論結論: : 在三羧酸循環的發酵過程中在三羧酸循環的發酵過程中, ,阻斷順烏頭酸酶水合酶阻斷順烏頭酸酶水合酶和異檸檬酸脫氫酶的催化反應和異檸檬酸脫氫酶的

11、催化反應, , 建立一種平衡關系，大建立一種平衡關系，大量積累檸檬酸量積累檸檬酸: : 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸 = 90= 90：3 3：7 7 a. a.絡合劑絡合劑( (亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀) )除去除去fefe2+2+, ,順烏頭酸水合酶的順烏頭酸水合酶的活性被抑制。活性被抑制。 b.b.檸檬酸的積累使檸檬酸的積累使phph值下降值下降, ,在低在低phph值下值下, ,順烏頭酸順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活, ,更有利于檸檬酸的積累并更有利于檸檬酸的積累并排出體外。排出體外。第三節、第三節、 氨基酸發酵機制氨基酸發酵機制 (

12、(一一) )、氨基酸發酵的機制和代謝控制、氨基酸發酵的機制和代謝控制 1 1、氨基酸發酵機制主要包括：谷氨酸族、氨基酸發酵機制主要包括：谷氨酸族( (谷、瓜、鳥、精谷、瓜、鳥、精氨酸等氨酸等) )、天冬氨酸族、天冬氨酸族( (賴、蘇、蛋等賴、蘇、蛋等) )、芳香族、芳香族( (苯丙、酪、苯丙、酪、色氨酸等色氨酸等) )、分枝鏈、分枝鏈( (亮、異亮、纈氨酸等亮、異亮、纈氨酸等) )。 2 2、氨基酸發酵代謝控制的一般措施：、氨基酸發酵代謝控制的一般措施： a a、控制發酵的環境條件；、控制發酵的環境條件； b b、控制細胞滲透性；、控制細胞滲透性； c c、控制旁路代謝；、控制旁路代謝； d

13、d、消除終產物的反饋調節作用、消除終產物的反饋調節作用 e e、降低反饋作用物的濃度；、降低反饋作用物的濃度； f f、促進、促進atpatp的積累的積累( (二二) )、谷氨酸發酵機制、谷氨酸發酵機制 1.1.谷氨酸生物合成途徑：谷氨酸生物合成途徑： empemp途徑、途徑、hmphmp途徑、途徑、tcatca循環、循環、dcadca循環、循環、coco2 2固定作用固定作用2. 2. 谷氨酸生物合成途徑的控制谷氨酸生物合成途徑的控制(1).(1).三羧酸循環的調節三羧酸循環的調節 通過馴育谷氨酸高產菌控制三羧酸循環下列酶的活性通過馴育谷氨酸高產菌控制三羧酸循環下列酶的活性: : a. -

14、a. -酮戊二酸脫氫酶應喪失或僅有微弱的活力。酮戊二酸脫氫酶應喪失或僅有微弱的活力。 b.cob.co2 2固定反應的酶系強固定反應的酶系強, ,使四碳二羧酸全部是由使四碳二羧酸全部是由coco2 2固定固定 反應提供反應提供, ,而不走乙醛酸循環而不走乙醛酸循環, ,以提高對糖的利用率。以提高對糖的利用率。 c.c.谷氨酸脫氫酶的活力很強谷氨酸脫氫酶的活力很強, ,并喪失谷氨酸對谷氨酸脫并喪失谷氨酸對谷氨酸脫 氫酶的反饋抑制和反饋阻遏。氫酶的反饋抑制和反饋阻遏。 (2).(2).氨的導入和控制氨的導入和控制 氨的導入主要方式氨的導入主要方式: : 糖代謝中間體還原氨基化糖代謝中間體還原氨基化

15、; ;天冬氨天冬氨酸或丙氨酸通過氨基轉移；谷氨酸合成酶途徑。酸或丙氨酸通過氨基轉移；谷氨酸合成酶途徑。 谷氨酸發酵受谷氨酸發酵受nhnh4 4+ +的影響。使用生物素缺乏菌的影響。使用生物素缺乏菌, ,在在nhnh4 4+ +存在時存在時, ,葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸; ; 當當nhnh4 4+ +不存在時不存在時, ,糖的消耗速度很慢糖的消耗速度很慢, ,生成物是生成物是 - -酮酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。 nadp nadp為輔酶的異檸檬酸脫氫酶和為輔酶的異檸檬酸脫氫酶和nadph+hnadph

16、+h+ +為輔酶的為輔酶的 谷氨酸脫氫酶形成共軛反應谷氨酸脫氫酶形成共軛反應, nadp, nadp濃度是實際上的濃度是實際上的 限速因子限速因子, ,添加氧化還原電位與添加氧化還原電位與nadpnadp相似的氧化還相似的氧化還 原染料原染料, ,并通以電流可促進還原氨基化作用并通以電流可促進還原氨基化作用, ,增加谷增加谷 氨酸產量。氨酸產量。(3).(3).控制細胞滲透性控制細胞滲透性 a a、控制生物素、油酸濃度或添加表面活性劑如吐控制生物素、油酸濃度或添加表面活性劑如吐溫溫8080、陽離子表面活性劑。引起細胞膜的脂肪酸成分的、陽離子表面活性劑。引起細胞膜的脂肪酸成分的改變改變, ,尤其

17、是改變油酸含量尤其是改變油酸含量, ,從而改變細胞膜通透性；從而改變細胞膜通透性； b b、加入青霉素或控制、加入青霉素或控制mn+mn+、zn+zn+濃度。抑制細胞壁的濃度。抑制細胞壁的合成合成, ,由于細胞膜失去細胞壁的保護由于細胞膜失去細胞壁的保護, ,細胞膜受到物理損細胞膜受到物理損傷傷, ,從而使滲透性增強。從而使滲透性增強。 c c、生產中菌種選育模型與控制方法、生產中菌種選育模型與控制方法: : 生物素缺陷型生物素缺陷型; ; 油酸缺陷型油酸缺陷型; ; 甘油缺陷型等。甘油缺陷型等。(4).(4).控制發酵的工藝條件控制發酵的工藝條件 谷氨酸發酵是人工控制發酵條件成功進行大規模生

18、谷氨酸發酵是人工控制發酵條件成功進行大規模生產的典型例子。產的典型例子。 主要的影響因子有：溶解氧、主要的影響因子有：溶解氧、nhnh4 4+ +、phph、磷酸生物、磷酸生物素、醇類和素、醇類和nhnh4 4clcl。 第第四節四節 抗生素發酵機制抗生素發酵機制1 1、抗生素的生物合成類型、抗生素的生物合成類型 a. a. 蛋白質衍生物蛋白質衍生物 簡單的氨基酸衍生物：環絲氨酸、重氮絲氨酸等；簡單的氨基酸衍生物：環絲氨酸、重氮絲氨酸等； 寡肽抗生素：青霉素、頭孢菌素等；寡肽抗生素：青霉素、頭孢菌素等； 多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等；多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等； 多肽大環內脂抗生素：

19、放線菌素等；多肽大環內脂抗生素：放線菌素等； 含嘌呤和嘧啶堿基的抗生素：曲古霉素、嘌呤霉素等含嘌呤和嘧啶堿基的抗生素：曲古霉素、嘌呤霉素等 b. b.糖類衍生物糖類衍生物 糖苷類抗生素：鏈霉素、卡那霉素等；糖苷類抗生素：鏈霉素、卡那霉素等； 與大環內脂連接的糖甙抗生素：紅霉素、碳霉素等；與大環內脂連接的糖甙抗生素：紅霉素、碳霉素等； 其他糖甙抗生素：新生霉素等。其他糖甙抗生素：新生霉素等。 c.c.以乙酸為單位的衍生物以乙酸為單位的衍生物 乙酸衍生物的抗生素：四環類抗菌素、灰黃霉素等；乙酸衍生物的抗生素：四環類抗菌素、灰黃霉素等； 丙酸衍生物的抗生素：紅霉素等；丙酸衍生物的抗生素：紅霉素等；

20、多烯和多炔類抗生素：制霉素、曲古霉素等。多烯和多炔類抗生素：制霉素、曲古霉素等。2 2 、青霉素、頭孢菌素的生物合成機制、青霉素、頭孢菌素的生物合成機制 青霉素、頭孢菌素的化學結構如下：青霉素、頭孢菌素的化學結構如下：3 3、鏈霉素的生物合成機制、鏈霉素的生物合成機制 鏈霉素的化學結構如下：鏈霉素的化學結構如下：4 4、抗生素生物合成的代謝調節方式、抗生素生物合成的代謝調節方式(1)(1)、細胞生長期到抗生素產生期的過渡、細胞生長期到抗生素產生期的過渡 次級代謝產物是在菌體生長到達相對靜止期才產生。次級代謝產物是在菌體生長到達相對靜止期才產生。在細胞生長階段在細胞生長階段, ,負責次級代謝產物

21、合成的酶受到阻遏。負責次級代謝產物合成的酶受到阻遏。 a.a.誘導因子在生長期末積累或從外源加入誘導因子在生長期末積累或從外源加入; ; b. b.初級代謝的終點產物耗盡初級代謝的終點產物耗盡; ; c. c.易被利用的糖源分解代謝物被利用后易被利用的糖源分解代謝物被利用后, ,便解除了阻遏作用便解除了阻遏作用; ; d. d.高能化合物高能化合物atpatp形成減少后，阻遏作用也就解除形成減少后，阻遏作用也就解除; ; e. e.在生長期，在生長期，rnarna聚合酶只能啟動生長期基因的轉錄作用；當生長停聚合酶只能啟動生長期基因的轉錄作用；當生長停 止后止后, ,酶的結構改變酶的結構改變,

22、,允許允許rnarna聚合酶啟動生產期基因的轉錄作用聚合酶啟動生產期基因的轉錄作用, , 負責抗生素合成的酶開始生成。負責抗生素合成的酶開始生成。 (2) (2) 酶的誘導作用酶的誘導作用 在抗生素合成期在抗生素合成期, ,參與次級代謝的有些酶是誘導酶。參與次級代謝的有些酶是誘導酶。需要底物或底物的結構類似物需要底物或底物的結構類似物( (外源和內源誘導劑外源和內源誘導劑) )。(3) (3) 分解代謝產物的調節控制分解代謝產物的調節控制 碳、氮分解代謝產物碳、氮分解代謝產物( (如葡萄糖如葡萄糖) )阻遏和抑制作用阻遏和抑制作用, ,抑抑制抗生素合成。解除分解產物阻遏的方法制抗生素合成。解除

23、分解產物阻遏的方法: : a. a.選育對葡萄糖代謝產物類似物抗性突變型選育對葡萄糖代謝產物類似物抗性突變型; ; b. b.培養過程中利用緩慢的碳源培養過程中利用緩慢的碳源, ,連續流加葡萄糖連續流加葡萄糖; ; c. c.使用含有慢慢向培養基內滲透營養物質的顆粒。使用含有慢慢向培養基內滲透營養物質的顆粒。（4 4）磷酸鹽的調節）磷酸鹽的調節 抗生素只有在磷酸鹽含量控制在生長的抗生素只有在磷酸鹽含量控制在生長的“亞適量亞適量”時才能合成。時才能合成。 磷酸鹽抑制抗生素合成的機制可能有以下二方面：磷酸鹽抑制抗生素合成的機制可能有以下二方面： a.a.抑制或阻遏抗生素生物合成途徑中有關酶的活力抑

24、制或阻遏抗生素生物合成途徑中有關酶的活力和合成。和合成。 b.b.改變代謝途徑。改變代謝途徑。 c.c.磷酸鹽可調節細胞內磷酸鹽可調節細胞內atpatp的形成。的形成。 (5) (5) 次級代謝產物的自身反饋調節次級代謝產物的自身反饋調節 在多種次級代謝產物的發酵中都發現了末端產物的在多種次級代謝產物的發酵中都發現了末端產物的反饋調節作用。反饋調節作用。 產生菌抗生素的生產能力與自身抑制所需抗生素濃產生菌抗生素的生產能力與自身抑制所需抗生素濃度呈正相關性。因此要選育生產能力強的抗反饋調節的度呈正相關性。因此要選育生產能力強的抗反饋調節的突變菌株。突變菌株。(6) (6) 初級代謝產物的調節初級代謝產物的調節 某些初級代謝產物可以調節次級代謝產物的合成的某些初級代謝產物可以調節次級代謝產物的合成的原因原因: : a. a.有一條共同的合成途徑有一條共同的合成途徑, ,當初級