1、實驗四 葉綠素的提取、理化性質和含量測定1. 實驗目的n提取葉綠素n葉綠素的物理性質n葉綠素的化學性質n葉綠素含量的測定2. 實驗原理 2.1 用含水的有機溶劑提取葉綠素 2.2 葉綠素的物理性質 吸收光譜 熒光現象 2.3 葉綠素的化學性質 取代反應 皂化反應2.1 用含水的有機溶劑提取葉綠體色素n葉綠素分子含有一個卟啉環的“頭部”和一個葉綠醇的“尾巴”n親水的“頭部”：鎂原子居于卟啉環的中央，帶正電性，與其相聯的氮原子則偏向于帶負電性，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質結合n親脂的“尾巴”：葉醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性2.2 葉綠素的

2、物理性質1) 吸收光譜2) 熒光現象3) 含量測定1) 葉綠素的吸收光譜2) 熒光現象葉綠素溶液的透射光呈綠色，其反射光呈紅色的現象。3) 含量測定n葉綠素a、b在紅光區的最大吸收峰分別位于663 nm 和645 nm；n葉綠素a、b在652 nm處有相同的比吸收系數（均為34.5），測OD652求出葉綠素a、b總量。n故葉綠素濃度 COD652 / 34.5 ( mg/mL)n葉綠素的含量（mg/g）= 葉綠素的濃度提取液體積稀釋倍數/樣品鮮重 Chl: 強吸收區: 640-700nm(紅) & 400-500nm(藍紫); 不吸收區: 500-600nm (呈綠） Carotene: 強吸

3、收區: 400-500 (藍紫); 不吸收區：500以上（呈黃色或棕色）不用藍光區，用652 nm2.3 葉綠素的化學性質1) 葉綠素的結構2) 取代反應3) 皂化反應1) 葉綠素的結構n葉綠素a與b很相似，n不同之處僅在于Chla第二個吡咯環上的一個甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。 2) 取代反應 稀酸 去鎂 銅代 濃酸 去鎂 水解卟啉環中的Mg處于不穩定的狀態，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等離子取代。 n稀酸 葉綠素溶液與稀酸作用，H+取代Mg后的產物為褐色的去鎂葉綠素； 去鎂葉綠素與Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等離子取代后的產物為銅代葉綠素等，深綠色；n濃

4、酸 葉綠素溶液與濃酸作用，除了代換Mg外，可使去鎂葉綠素迅速分解出葉綠醇，并形成去鎂葉綠酸，呈褐綠色。葉綠素去鎂葉綠素銅代葉綠素（穩定而不易降解，常用醋酸銅處理來保存綠色植物標本）3) 皂化反應n葉綠酸是二羧酸，其中一個羧基被甲醇酯化，另一個被葉綠醇酯化。葉綠素是葉綠酸的酯，能發生皂化反應。n葉綠素與堿皂化的鹽能溶于水，可將葉綠素和類胡蘿卜素分開。n葉綠素的鹽形成以后，易溶于稀乙醇溶液中，不能進入苯層n類胡蘿卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中n一部分苯分散在水中形成乳膠體，出現一層乳白色的溶液n低溫下發生皂化反應的葉綠體色素溶液，易乳化而出現白色絮狀物，溶液渾濁，且不分層 3 材料、試劑與配備（

5、1）材料：菠菜葉片（2）儀器設備： 研缽，漏斗，剪刀，試管，試管夾，容量瓶，分光光度計，水浴鍋等（3）試劑：95%乙醇，苯，濃鹽酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂4.1 葉綠素的提取1. 新鮮菠菜葉片，剪碎成小塊（去掉中脈）混勻；2. 稱取剪碎的樣品3.0 g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鎂粉及2-3 mL的95%乙醇，研磨勻漿（豆漿狀），再加乙醇混勻；3. 過濾至25 mL容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣，最后連同殘渣一起過濾（ 直至濾紙和殘渣中無綠色為止）最后用乙醇定容至25mL，搖勻。4 實驗步驟4.2 葉綠素的熒光 取3 mL葉綠素提取原液，觀察其透射光、反射

6、光的顏色；4.3 葉綠素含量的測定 取5mL葉綠素溶液移入50 mL容量瓶，用乙醇定容。 1) 葉綠素吸收光譜 以95%乙醇作為空白對照，在400-700 nm之間，每隔20 nm讀OD值，然后以波長為橫坐標，以OD為縱坐標作圖 2) 葉綠素含量測定 以95%乙醇作為空白對照，測OD6524.4 葉綠素的化學性質 1) 取代反應 稀酸n取5 mL葉綠素原液，一滴滴加入醋酸，觀察顏色變化；n向上述加醋酸的葉綠素溶液中加少量CuAc顆粒，65水浴加熱，觀察其顏色變化。 濃酸n取5 mL葉綠素原液，加入一滴濃鹽酸，觀察顏色變化。 2) 皂化反應 取3 mL葉綠素原液，加1 mL 20% NaOH-甲

7、醇溶液，搖勻， 65水浴5 min； 取出冷卻后，先加3 mL苯，再加3 mL水（沿壁慢慢加入），輕輕搖勻，靜置觀察其分層現象。處 理 顏色變化/分層 原 理熒光現象醋酸CuAc濃HCl皂化反應5 結果記錄與數據處理5.1 實驗現象記錄葉綠素的理化性質5.2 繪制葉綠素吸收光譜曲線5.3 葉綠素含量計算公式葉綠素的含量（mg / g）= 葉綠素的濃度體積稀釋倍數/樣品鮮重6 注意事項操作應在弱光下進行 ？研磨時間盡可能短，以不超過2分鐘為宜分光光度計的正確使用(更換波長后要調0)皂化反應最后做 在低溫下發生皂化反應的葉綠體色素溶液，易乳化而出現白絮狀物，溶液渾濁，且不分層。可激烈搖勻，放在30

8、-40的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。 7 思考題提取時為何要加入MgCO3？為何選用652 nm 測葉綠素的含量？解釋皂化反應的分層現象。 4.2 葉綠素的熒光 取3 mL葉綠素提取原液，觀察其透射光、反射光的顏色； 4.3.1 葉綠素吸收光譜 以95%乙醇作為空白對照，在400-700 nm之間，每隔20 nm讀OD值，然后以波長為橫坐標，以OD為縱坐標作圖 4.3.2 葉綠素含量測定:以95%乙醇為空白，測OD652 4.4.1 取代反應 4.4.1.1 稀酸：n取5 mL葉綠素原液，一滴滴加入醋酸，觀察顏色變化；n向上述加醋酸的葉綠素溶液中加少量CuAc顆粒，65水浴加熱10 min，觀察其顏色變化。 4.4.1.2 濃酸n取5 mL葉