1、 酶 組 織 化 學 （ e n z y m e histochemistry）是利用組織細胞內酶具有催化某種反應的特性來檢測酶活性。一般是用凍結或固定的切片，再一定條件下（具有酶的底物等）全酶進行催化作用，產生一種可見產物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對酶的活性進行定位或定量研究。 第二章第二章 酶組織化學酶組織化學10/21/20211 特點： 在原位檢測 檢測酶的活性而不是酶分子本身酶的分類：按生物化學分類六大類 氧化還原酶 轉移酶 水解酶 裂解酶 異構酶 連接酶常用檢測方法常用檢測方法1沉淀法 金屬沉淀法：ca+co+法；pb法 偶聯法：重氮鹽法 靛原法 四唑鹽法22后偶聯法po

2、st-coupling（acp）3合成法4底物膜法 設計半透膜 切片/ 孵育法 影響酶組化實驗的關鍵因素 酶活性的保存a）固定：酶組化的固定劑有教嚴格的限制，不 同的酶適用不同的固定劑 抑制酶活性和細胞化學成分活性的重金 屬鹽hg、cr、pb等不能用做固定劑。 慎用醛 3b）取材：快捷，實驗準備充分。冰結切片應先備液氮防止酶活性喪失。橫冷箱切片稍固定（丙酮 氯仿=1 1）4，510分鐘，但脂溶性蛋白脫落。 底物濃度 a）量要足夠1 20 v/ v b）孵育法只能用一次，配制 時要適量（節儉） ph和滲透壓 應以緩沖液調節 溫度控制與時間：室溫37（40min） 4（510min）4 捕獲劑 亦

3、要求一定濃度，要以反應原位瞬 時沉淀。 激活劑與抑制劑（對照）a）兩者的選擇都應具有特異性。b）要有適當的濃度范圍 時間：通過實驗自行摸索。任何配方都是一 個很大的范圍（指時間），受多種因 素的影響，因藥品的質量、環境因素 的變化而變化。故不可輕信之。 擴散：控制反應速度，避免擴散（冰凍 切片孵育尤應注意）5 對照：必須設立對照，以防非特異反應。 這對結果的解釋非常重要。 對結果的分析，應考慮如下幾個問題：經過凍結或固定后組織細胞破壞，酶究竟 能保留多少？酶是否在原位？反應中多少酶起了作用？酶的活性是否代表細胞生活時的活性？沉淀的產物是否代表酶蛋白分子，時間延 長，會不會改變？是否有擴散移位6

4、 一、鈣鈣鈷法顯示堿性磷酸酶鈷法顯示堿性磷酸酶 alkaline phosphatase （alp）原理原理以天然存在的甘油磷酸鈉為底物，經酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為 磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產物為黑色的硫化鈷沉淀。反應式如下：7方法方法標本：標本：大白鼠腎、小腸恒冷溫箱切片（載片） 厚6微米。固定：丙酮 氯仿（1 1）混合液。4 25切片標本入下列孵育液中，37，5分鐘 孵育液： 3甘油磷酸鈉 6ml 底物 保 2巴比妥鈉 6ml 調ph 證 2氯化鈣（無水） 9ml 沉淀劑 新 2硫酸鎂 6ml 激活劑 鮮 蒸餾水 3ml 30ml 將孵育液混勻，若渾濁可過濾，

5、調ph至9.4。 流水流水洗2分鐘后入蒸餾水 入2硝酸鈷，5分鐘（小腸可3分鐘） 置換 流水洗5分鐘，入蒸餾水。 入0.5硫化胺，2分鐘。 置換 流水洗10分鐘，入蒸餾水。 入mayer氏蘇木精染液(復染核)1分鐘 流水洗5分鐘蒸餾水。 甘油明膠或apathy糖膠封固。 結果結果：腎小體（近端小管）刷狀緣、小腸絨毛 紋狀緣和 血管內皮出現黑色的硫化鈷沉 淀，顯示alp活性強 。 alp為一種膜酶，廣泛存在于腎小管、小腸 絨毛、膀胱、腎上腺、包曼氏囊、肝、脾、 乳腺及 卵巢等細胞膜，與細胞的吸收有關。對照對照 無底物孵育，以蒸餾水代替孵育液中的3 甘油磷酸鈉，其余各步進行同上。 加熱滅活酶活性。

6、 加抑制劑，左旋咪唑0.11.0mmol/l注意事項注意事項ca2+要足量 硫化鈉（nh4）s 配置成淡黃色，可提供 s2-滴23滴 用水將鈷離子洗凈，以防止出現假陽性。 有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色 素）出現，可影響結果。 本法可用顯示：5核苷酸酶、肌蛋白 atpase、alp 二、鉛法鉛法顯示酸性磷酸酶顯示酸性磷酸酶 （gomori，1950 lojda，1979）原理原理 以甘油磷酸鈉為底物，在酸性ph下，被acp水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成磷酸鉛沉淀。在被s2-置換，最終生成硫酸鉛棕色沉淀。反應式如下： 酸性磷酸酶acid phosphatas（acp） acp的特性 ph

7、 4.55.5適宜 激活劑：mn2+ 抑制劑：naf，有些acp為cu2+、酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。acp定位定位 溶酶體（顆粒狀）內； 溶酶體外acp存在于er和胞液。 該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、 腎上腺。方法方法標本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚6 微米。固定：冰凍片或橫冷箱切片。凍融，有時也可 用甲醛，但影響活性。 本實驗不固定或固定于丙酮 氯仿（1 1） 混合液，4，25min步驟：步驟： 將標本放于下列孵育液中 37， 1015 孵育液：0.1m醋酸緩沖液，ph5.2 15ml 0.24硝酸鉛 15ml 3甘油磷酸鈉 3ml 33ml 混勻，置37水浴中153

8、0分鐘后，過濾。 于37蒸餾水中洗2次，每次1分鐘。（溫 蒸餾水洗） 入5硫化胺，12分鐘。 流水沖洗35分鐘后，換蒸餾水。 （可用mayer蘇木素復染核） 用甘油明膠或apathy氏糖膠封固。結果結果酶活性部位棕黑色硫化鉛沉淀。 分布于腎近曲小管細胞核周圍，肝細 胞毛細膽管周圍均有棕黑色顆粒。對照對照孵育液內加0.01m naf（13.9mg / 33ml）（） 注意事項注意事項 鉛離子的濃度 關鍵問題，沒有底物，有 些組織吸附鉛離子（+），因此必須用naf 抑制酶活性排除假陽性反應。 孵育時間不可過長，否則染色擴散或核染色。應用范圍應用范圍 “鉛法”適用于：acp，5-核苷酸酶g6p酶;

9、膜atpase mitoatpase ttpase（硫胺素焦磷酸酶） 三、偶氮偶聯法顯示偶氮偶聯法顯示acp原理原理 以奈酚的衍生物磷酸脂naphthol asbl phosphate為底物，在酸性ph（5.2）下，經酸性磷酸酶水解釋放出naphol asbi，立即與六氮化對品紅偶聯，生成紅色偶氮染料，用以代表酸性磷酸酶活性。方法方法標本：標本：大白鼠腎、肝橫冷箱切片（載片），厚 6 微米。 不固定或固定于丙酮 氯仿（1 1）混 合液內，4 ，25min 標本入下列孵育液，37，3060分鐘。 孵育液：磷酸奈酚asbi 15 mg 溶于二甲基亞砜 0.6 ml 六氮化對品紅 緩沖液 30 ml

10、 30.6 ml 充分混勻并過濾 蒸餾水洗 入mayer蘇木精內染1分鐘。 流水沖5分鐘后入蒸餾水。 用apathy糖膠或甘油明膠封固。結果結果 酶的活性部位呈紅色，核蘭色。 分布于腎近端小管核周，肝毛細 膽管周圍。 acp是溶酶體的標志酶。 六氮化對品紅液的配制（30ml） 4對品紅鹽酸溶液 堿性品紅 400mg 濃鹽酸 2 ml 蒸餾水 8ml 4nano3配好后于冰箱保存用時取1ml。+ 等量混勻（各取1ml），蓋嚴并置室 溫靜止一分鐘，待混合液變為淡黃色 倒入28ml 2.72醋酸鈉溶液，用1n naoh調ph至5 5.5即成。 四、四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶對照

11、對照用抑制劑naf濃度為10mmol/l ca2+ 濃度為10mmol/l注意事項注意事項 六氮鹽濃度不能太高 背景會略帶黃色應用范圍應用范圍 本法用于alp、acp、非特 異性脂酶。原理利用原理利用 利用h受體的h2，使四唑還 原成甲 月替 ：反應式如下：本實驗：本實驗：以琥珀酸（鈉鹽）為底物，在酶的作 用下脫氫，人工合成的硝基藍四唑（nitro bt）為受h體，其接受h后被還原成甲月替 呈紫色以代表琥珀酸脫氫酶的活性。 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標志酶之一。 抑制物：抑制物：丙二酸鹽（競爭抑制），磷酸 鹽，氯化物，蘇拉明草酰乙酸 （競爭抑制）凡與-sh基化合的 作用劑皆抑制其活性。方法方法 標

12、本標本：大白鼠肝、腎或心肌。橫冷箱切片，后 6微米不固定。 步驟：步驟： 將標本放入下列孵育液中，37，約5分鐘。 孵育液：nitro bt 10mg 0.1mpbs，ph7.8 10ml pms（吩嗪硫酸甲酯） 1mg 徐徐加溫，使其溶解，冷卻過濾。 再加入琥珀酸鈉 80mg 蒸餾水洗凈 apathy氏液糖膠封固結果結果 酶活性部位成藍紫色沉淀。此標本內 所見藍紫色顆粒即線粒體。對照對照 孵育液去底物，加入等量蒸餾水，同 時孵育（）注意注意 甲月替易溶于脂，反應擴散時組織內脂滴被染。 加入pms（中間遞氫體）定位更加準確。 如果聚乙烯醇pva，可以保護線粒體膜，使 反應局限在線粒體內。應用范

13、圍應用范圍 適用于：甲胺氧化酶、乳酸脫氫 酶、琥珀酸脫氫酶。 五五 、dab法法 顯示過氧化物酶顯示過氧化物酶原理原理 過氧化物酶分解h2o2的過程中，下面反應不直接發生：ah2（供氫體）+h2o2a（供氫體的氧化物）+2h2o2實驗可知，有稱為復合物 、的酶底物（受氫體）復合體生成，在復合體最后分解為酶和水時，游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學中所使用的供氫體應是含有色原性基團的發色物質，如奈酚和聯苯胺。光鏡顯示方法光鏡顯示方法（1）孵育液的配置： 預孵育液： dab 4hcl 10mg 溶于蒸餾水 5ml 0.2m磷酸緩沖液（ph6.5） 5ml fahimi孵育液: dab 4h

14、cl 10ml 溶于蒸餾水 5ml 0.2m磷酸緩沖液（ph6.57.0） 5ml 0.3h2o2 0.1ml grahamk孵育液： dab 4hcl 5mg 0.05m th緩沖液（ph7.6） 10ml 1h2o2 10ml lojda 孵育液： 0.1n苯基對次甲苯二胺 25ml 0.1-萘酚 25ml0.3h2o2（新配） 1ml方法方法 固定：溫度4，30分鐘（3戊二醛固 定液：20戊二醛15ml，或25 戊二 醛12ml 0.2 m磷酸緩沖 液50 ml，蒸 餾水加至100ml止）； 洗滌：洗滌三次以上，每次15分鐘，或 過濾。 切片：cryostat制成切片（510m） 染色步驟染色步驟 切片入下列孵育液中 a預孵液：室溫下1030分鐘 b后孵液： fahimi孵育液，室溫560分鐘 gropam-karnovsky液，室溫，310分鐘 洗滌：蒸餾水漂洗 染核：亞甲藍染核 封固：甘油明膠封固