1、該手冊尚屬于編寫階段，如有錯誤請告知作者，以便盡快更正SSR操作手冊第一部分：DNA制備一、DNA抽提（酚氯仿抽提）1 研 磨：分別取0.05g組織，加入液氮研磨粉碎，將粉末轉至1.5mL的離心管中。加入500ul 裂解液。0.5ulRNA酶，20ul20mg/ml蛋白酶K。55水浴消化至完全溶解。2 加入等體積飽和酚（Phenol astuorated）輕輕混勻（混勻半小時）于4以12,000rpm離心20min.3小心移取上清液于新的滅菌管后加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）混勻（混勻不能太劇烈，以保證DNA完整性），于4以12,000rpm離心15min。4 小心移取上清液于新

2、的滅菌管后加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）上下顛倒混勻，于4以12,000rpm離心15min。5沉淀DNA： 小心移取上清液于新的滅菌管，加1/10體積（50ul）的3M的NaAC和2倍體積（1000u L） 預冷的無水乙醇（-20）于-20冰箱沉淀過夜沉淀DNA。6于4以10,000rpm離心15min，棄上清（小心不要吸走沉淀）。7 將沉淀于室溫放置放置，至無酒精味（不要過分干燥）。8溶解：加入適量的TE溶解（50uL200ul），置于4冰箱1-2h，使DNA充分溶解。9 保存：將DNA樣于-20冰箱保存備用。（梁利群）：裂解液采用改進的配方(成份：10 mmolL EDTA，200u

3、 gmL ProteinaseK05 Sarcosyl)，取05 g尾鰭剪碎，加入500 ul裂解液，50消化12 h，94 消化4 min，加等體積酚飽和溶液于機械手上緩慢轉動抽提2 h，5 000 g離心5 min，吸上清，用酚：氯仿：異戊醇(體積比25：24：1)抽提2次，最后用氯仿：異戊醇(體積比24：1)抽提1次，將上清加入2倍體積的無水乙醇沉淀，15000 g離心20 min，再用70 乙醇洗滌2次，離心干燥機抽干，加入適量的110TE(10 mmolLTrisHCl，pH80； 1 mmolLEDTA，pH80)緩沖液溶解，4保存備用注意：1 蛋白酶K和RNA酶保存于-40冰箱中

4、。使用時取出后置冰上融化，裂解液室溫保存，若有沉淀則加熱（水浴或微波）溶解后使用。2 加氯仿：異戊醇作用為去蛋白，可再重復一次，但會損失DNA。3 苯酚是蛋白質的變形劑，氯仿有利于分相，除去蔗糖及痕量酚，異戊醇可減少氣泡，溶解RNA。讓離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收，也可以用1倍體積的異戊醇沉淀DNA，室溫下放置15-30min即可。DNA降解原因：1 從動物身上取下的組織沒有立即處理或冰凍。2 用于抽提的樣品，或已經抽提的RNA樣品存放于-5-20,而沒有存放于-60-70。3 使用了Polytron或其他高速的勻漿器勻漿樣品。 每mg組織或1*106培養細胞預期的DNA產量：

5、肝和腎34ug骨骼肌、腦組織和胎盤23ug培養的人、小鼠、大鼠細胞57ug纖維母細胞57ug二、DNA質量檢測和定量DNA質量檢測：使用瓊脂糖凝膠檢測 1 制膠：0.8%1%瓊脂糖凝膠。整塊膠版需60ml瓊脂糖凝膠，按比例加瓊脂糖和0.5%TBE緩沖液于錐形瓶中（量多可蓋上PE手套，并刺幾個洞，防止濺出），微波爐加熱3min，中間要混勻35次。直到瓊脂糖充分溶解。靜置待50或手可握瓶的溫度將瓊脂糖凝膠緩慢倒入模具（插好合適的梳子）中，冷卻（有氣泡需把氣泡趕出）。（冷卻至少半小時，且不可過長，如需急用，可放到4冰箱中冷卻。）2 電泳 3 染色 EB染色，置膠于EB（ethidium bromid

6、e）中10s，迅速置于超純水510min。4 拍照注意：EB是強誘變劑且劇毒。操作需戴手套。用后需妥善處理。三、DNA定量：使用核酸蛋白檢測儀，定量分析1 比色皿用滅菌水沖洗三次2 加99ul滅菌水，調零。3 拿出比色皿，加1ul抽提DNA。用槍混勻，測OD值記錄：DNA含量OD260/OD280 （1.6-1.8較好，1.8表明有RNA污染）OD260/OD230如果是RNA樣品，則OD260/OD2802.0.若1.8,純的RNA其260/280值應2.0，比值低于1.8或2.0，表示存在蛋白質或酚類物質的影響，A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸26

7、0/230的比值大于2.0。A320檢測溶液的渾濁度和其他干擾因子，純樣品A320一般為0苯酚是蛋白質的變性劑，氯仿有利于分相，除去蔗糖及痕量酚，異戊醇可減少氣泡，溶解RNA，讓離心后上下層的界面更加清晰，方便水相的回收，也可用1倍體積的異戊醇沉淀DNA，室溫下放置1530min即可。銀染：在醋酸中固定測序膠除去電泳液和凝膠中的尿素，并防止小的延伸產物的擴增，換幾次蒸餾水除去固定劑，膠在硝酸銀和甲醛中染色。溶液配制：凝膠上樣緩沖液：98%甲酰胺，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯氰，10mmol/LEDTA引物探索：引物溶液濃度：1nmol/100ul=10pmol/ul=10umol/L引物濃度溫度1溫度2溫度3KPC9545854KPC451nmol/100ul585854KPC501nmol/100ul5854KPC431nmol/100ul6054LYC00151nmol/100ul