1、EMSA試驗成功的關鍵因素:1. 1.試驗設計,主要是你用藥品刺激細胞時,設計的藥品濃度和時間剃度的問題,這個很關鍵,很多同學不注意這一點,最后試驗確實是拿不到陽性結果,比如我一前一個朋友用藥物處理SGC7901細胞,就是因為時間點設計的不好EMSA試驗結果是陰性的,后來根據自己藥品刺激的特性重新設計了刺激時間剃度,最終得到陽性結果! 所以這個設計很關鍵!給一個個人的實驗總結希望能幫助大家:一是受體結合類的直接刺激激活信號通路的方法，一般達到EMSA核轉運高峰的時間比較短，大概控制在30min-2h之間，很多時候都是在45min和1h達到高峰，當然還有合適的濃度！二是是你用的是藥物刺激產生受體

2、可能時間會長一些,因為藥物還有一個滲透和刺激產生細胞因子的過程.時間可以長一些,主要根據自己的藥物刺激特性確定時間點.2.核蛋白樣品的制備;制備蛋白樣品的關鍵是:1.注意用專用的和核蛋白抽提試劑來做,才能使制備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構像.2.掌握好核蛋白的濃度和純度,尤其是濃度. 能入核的蛋白本來就不是很多,所以核蛋白的濃度往往不會很高,但是EMSA試驗對核蛋白的濃度要求還是聽高的! 一般要求在1ug/ul以上!有時候稍微低于這個數量級也可以,但是不能太低,否則影響結合反應拿不到結果. 這就要求核蛋白抽提盡量避免核蛋白的損失.同時,一般制備核蛋白的材料為細胞和組織, 細胞要比組織好做

3、的多,最重要的是用細胞得到核蛋白的純度比組織要高很多. 而組織抽提后雜蛋白相對較多!雜蛋白多會影響試驗結果不容易得到EMSA陽性結果!3.探針的制備: 又很多站友都在問我生物素標記到3端還是5端,其實我覺得最好還是兩端都標記,這樣才能更好的提高靈敏度, 國內的標記技術我還不是很了解,我們這邊的探真都是國外定做的,還算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸-標記生物素-純化-退火合成雙鏈.也是一個比較復雜的過程.4.EMSA實驗技術. 這一點主要是操作的細節問題! 下面會更細的談到.技術要點: 關于技術要點,我在這里只提一下關鍵的幾點需要注意的細節操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制膠 必須是

4、非變性PAGE凝膠,我們實驗室一般用6.5%的非變性膠.制膠很重要,直接影響電泳的效果!一般控制在5分鐘凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油） 1.0mldH2O（蒸餾水） 14.8mlTEMED（四甲基乙二氨） 20l脫氣10min 10% AP（過硫酸氨） 120l總量 20.0ml2. 一般試劑盒包括的試劑l 10X Binding Buffer（10X 結合反應液）(-20 oC) l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸競爭物）(-20 oC) l 6X Loading B

5、uffer（10X 上樣緩沖液）(4 oC) l Cold oligonucleotides（非標記競爭性寡核苷酸）(-20 oC) l Biotin-Labeled Probe（生物素標記探針）(-20 oC) l Streptavidin-HRP（鏈霉親核素-HRP）(4oC) l 2Blocking Buffer（2 封閉液）(4 oC) l 5Washing Buffer（5 洗滌液）(4 oC) l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC) l Binding-membrane（結合反應膜）(RT) 3. 結合反應每次結合反應需1-5l核蛋白(根據核蛋白濃度

6、而定)，根據不同的核提取物濃度加入核提取物用量，用雙蒸蒸餾水將終體積調節到15l（1） 結合反應體系：10X 結合反應液 1.5lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0l細胞核提取物* ? l雙蒸水* ? l混勻室溫靜置20 分鐘 生物素標記的探針 0.5l總量 15l混勻室溫靜置20分鐘或以上。（2）特異性反應確認競爭反應體系：10X 結合反應液 1.5lPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0l細胞核提取物 ? l未標記的競爭性寡核 2.0l 雙蒸水* ? l混勻室溫靜置20 分鐘 生物素標記的探針 0.5l總量 15l混勻室溫靜置20分鐘或以上。其中:探針用量: 這相當于10-

7、50fmoles的DNA探針。我們通常是最少50fmol.蛋白樣品用量: 一般用量在2-20ug(控制在1-5l)蛋白, 總體系15ul. 細胞核抽屜物濃度都比較低,組織的一般都比較高,因為雜蛋白較多.poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結構，可抑制蛋白對標記探針的非特異結合，避免假復合物。 在凝膠遷移反應中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA結合蛋白結合，比如轉錄調節因子的非特異結合。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。

8、對核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。未標記的競爭性寡核: 做為競爭的探真來說,其實就是沒有標記的轉爐銀子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100倍. 再這里我引申的解釋一下其他的對照的含義:. 常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白標記探針)； 陰性對照反應(核蛋白標記探針); 陽性對照(核蛋白標記探針) 探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白標記探針標記探針100倍量的未標記探針)； 突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的 核蛋白標記探針標記探針100倍量的未標記突變探針)； Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋

9、白標記探針目的轉錄因子的特異抗體).4. 預電泳和電泳：0.25X TBE在冰上120V 預電泳1小時; 務必換掉預電泳的緩沖液, 用新的0.25X TB低溫下150V，電泳約60分鐘。 注意橫壓電泳的時候注意電流的數字變化,記錄開始電泳和電泳結束的電流數據的變化!5. 電轉運在0.5X TBE中390mA電轉移40分鐘, 注意轉運膜的選擇, 有一種離子加強型的轉運效果比較好! 我當初選擇過一般的和離子加強型的,還是離子加強型結合效果好!6.紫外交聯: 正規的應該是紫外交聯儀的使用,但是很多單位沒有交聯儀,那就用無菌操作臺上的紫外等下10cm處交聯10分鐘就可以了!這個數據是我做了好多次試驗才摸索出來的!條件比較成熟!可以借鑒!7. 化學發光反應包括Blocking Buffer 30分鐘封閉, Streptavidin-HRP標記, Washing Buffer洗滌; Equilibration Solution平衡, 這些按照規定操作即可! 沒有太多的細節,只是注意兩點,一是期間結合膜的表面一定不能干燥!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液體中混韻后在將膜放在液體中孵浴.